生物钟调控基因的高通量siRNA筛选
A high-throughput siRNA Screen for Circadian Clock Modulators   

材料与试剂

材料

1. 1.5 ml离心管 (QSP, 509-GRD-Q)
2. 15 ml离心管 (JET BIOFIL, CFT-011-150)
3. 50 ml 离心管 (JET BIOFIL, CFT-011-500)
4. 10 ml 移液管 (JET BIOFIL, GSP010010)
5. 10 cm dish (NUNC, 150466)
6. 384孔板 (Corning, CLS3570BC-50EA)
7. 0.22 μm滤器 (JET BIOFIL, FPV213500)
   
   

试剂

8. DMEM (Thermo Fisher, 12430047)
9. Penicillin-Streptomycin (BIOSERA, XC-A4122)
10. 胎牛血清 (LONSERA, S711-001s)
11. Trypsin (Thermo Fisher, 25200072)
12. PBS (Thermo Fisher, 21300058)
13. Opti-MEM^TM I Reduced Serum Medium (Thermo Fisher, 31985070)
14. 5x siRNA buffer (Dharmacon, B-002000-UB-100)
15. DharmaFECT 1 Transfection Reagent (Dharmacon, T-2001-02)
16. alamarBlue^TM Cell Viability Reagent (Thermo Fisher, DAL1100)
17. ONE-Glo^TM Luciferase Assay System (Promega，E6120)
    

仪器设备

1. 细胞培养箱 (Thermo scientific, Heracell 150i)
2. 生物安全柜 (Eppendorf, 1300 SERIES A2)
3. 离心机 (Eppendorf, centrifuge 5810 R)
4. 细胞计数仪 (Beckman Coulter, Z2)
5. 自动化分液仪 (Thermo Fisher, Multidrop Combi)
6. 混匀仪 (Eppendorf, ThermoMixer comfort)
7. 多标记微孔板检测仪 (PE, envision)
   

实验步骤

1. siRNA的制备
   
   1.1

   将siRNA库（Dharmacon, Mouse siGENOME siRNA Library, 申请于生物化学与细胞生物学研究所化学生物学技术平台）的384孔板室温放置10 min 后，水平离心机中800 x g离心2 min，然后小心地撕去孔板上的膜；
   1.2

   使用自动化分液仪 Multidrop Combi（见图1）在含有siRNA的孔中加入10μl 1x siRNA buffer；
   
   
   图1. 自动化分液仪 Multidrop Combi
   
   
   1.3

   使用1x siRNA buffer分别稀释Non-targeting Pool siRNA及阳性对照siRNA至0.1 μM，并加入siRNA孔板中（如图2，第二列）；
   1.4

   在水平离心机中200 x g离心1 min；
   
   
   图2. siRNA板排布方式.（橙色为阴性对照，绿色为阳性对照，蓝色为siRNA库，白色为空格；红色虚线为Multidrop Combi分液路径）
   
   
2. 转染试剂的制备
   
   2.1

   用Opti-MEM按照体积比1:100稀释DharmaFECT 1转染试剂；
   2.2

   使用Multidrop Combi将上述转染试剂溶液加入siRNA孔板内（10 μl/孔）；
   2.3

   水平离心机200 x g离心1 min，将siRNA与转染试剂混匀；
   2.4

   室温静置20 min；
3. 细胞悬液的制备
   
   3.1

   将MEF细胞计数后加入适当体积DMEM培养基，配制成浓度为4000细胞/30μl的细胞悬液。
   3.2

   使用Multidrop Combi将上述细胞悬液加入siRNA孔板，30 μl/孔；
   3.3

   为减少边缘效应，在未使用的孔中加入50 μl PBS或DMEM；
   3.4

   将加好转染试剂和细胞的siRNA孔板在水平离心机中200 x g离心2 min，放置于CO₂培养箱中培养48 h；
4. 换液：（用于同步细胞节律，换液后27h时PER2表达处于波峰位置）
   
   4.1

   采用倒扣离心的方式（如图3）在水平离心机中200 x g离心10 s，将孔中的培液去除；
   
   
   图3. 倒扣离心步骤（1. 将孔板中大部分培液倒出；2. 将灭菌过的纸放在板盖上；3. 将孔板倒扣在板盖上； 4. 如图所示将孔板放入离心机）
   
   
   4.2

   使用Multidrop Combi加入新的DMEM，50 μl/孔（为防止将细胞冲起，将程序调整为慢速）；
   4.3

   水平离心机中200 x g离心1 min，放入培养箱中继续培养27 h；
5. 细胞数量检测
   
   5.1

   使用Multidrop Combi向384孔板中加入alamarBlue，5.5 μl/孔
   5.2

   水平离心机中200x g离心2 min，放入培养箱中继续培养3 h；
   5.3

   检测前，将板子在室温静置30 min，然后用酶标仪（Ex: 530-560 nm, Em: 590 nm）检测荧光值；
6. 检测生物发光值
   
   6.1

   采用倒扣离心的方式在水平离心机中200 x g离心10 s，将孔中的培液去除;
   6.2

   迅速使用Multidrop Combi加入ONE-Glo，10 μl/孔；
   6.3

   水平离心机中800 x g离心2 min，放入混匀仪中550 rpm混匀3 min，然后在酶标仪中检测生物发光值。

结果与分析

1. SD值，C.V值及Z-factor值计算
   在筛选开始前，应先检测系统的稳定性。SD值为标准差；C.V值为离散系数，用于评估组内数据的离散程度；Z-factor也被称作Z-因子，用于评估筛选体系是否适合高通量筛选，Z-factor值介于0.5-1.0之间时，证明筛选体系适合进行高通量筛选。我们使用阴性对照和阳性对照分别做了40个复孔用来测试系统稳定性。结果见图4。根据alamarBlue值的计算，C.V值较小，证明孔间细胞数量基本一致；在生物发光值的检测中，阴性对照和阳性对照的C.V值较小，并且Z-factor值大于0.50，证明整个筛选系统比较稳定，可以用于大规模筛选。
   C.V = σ/μ.
   Z-factor = 1 - (3 * (σ_p + σ_n) / | (μ_p - μ_n) |).
   (σ为标准差，μ为平均值,p为阳性对照，n为阴性对照)
   
   
   图4. SD值，C.V值及Z-factor值
   
   
2. 细胞数量检测
   由于本次实验通过检测生物发光值来检测不同的siRNA对PER2的影响，检测alamarBlue主要是为了排除siRNA造成细胞数量改变，从而导致生物发光值降低或增高。在我们的结果中，确实发现某些基因的siRNA会明显改变MEF细胞数量，在后续的分析中会将这些siRNA排除。
3. 生物发光值
   由于siRNA的三个复孔位于不同的384孔板中，因此每个384孔板中均应加入阴性对照和阳性对照（如图5，第二列）；并且在分析时，首先将每个siRNA的值与板内的阴性对照做标准化处理，然后再计算三重复的平均值。
   
   
   图5. Bioluminescence值示例
   
   板内阴性对照平均值M = (B2+D2+F2+H2+J2+L2+N2)/7
   其他值分别除以M，做标准化处理。
   
   

可能遇到的问题及调整建议

1. 转染效率低
   尝试使用不同的转染试剂或者对转染试剂的用量进行调整。
2. 细胞数量过少或太多
   在正式筛选开始前，应根据实验目的和筛选策略，选择大致的细胞密度范围进行预实验，以确定筛选时的细胞密度。细胞悬液制备时，应采用多次计数求平均值的方法。
3. 生物发光值太低
   
   3.1

   确定使用的细胞可以稳定表达荧光素酶，并且表达量不会太低；
   3.2

   使用合适的生物发光检测试剂以及检测试剂的用量。本次实验中，每孔中加入10 μl ONE-Glo，可以根据细胞中荧光素酶的表达量，进行调整。
4. 板内阴性对照误差较大
   
   4.1

   每次进行实验前，均应检查Multidrop Combi不同通道的通畅情况，防止因管道阻塞造成加入孔中体积不一致；
   4.2

   实验过程中，保证Multidrop Combi的软管插入液体底部，防止吸入气泡，并经常混匀。
5. 细胞贴壁不牢，无法进行倒扣离心
   可以不倒扣离心，直接在培液中加入ONE-Glo的方式检测生物发光值，但要对检测试剂用量，混匀时间等条件进行优化。
   

溶液配方

1. DMEM完全培养基
   在1 L DMEM中加入100 ml 胎牛血清和10 ml P-S双抗
2. PBS
   在1 L ddH₂O中加入9.6 g PBS粉末，完全溶解后，过0.22 μm滤器至已灭菌的玻璃瓶中。
   

致谢

感谢中国科学院生物化学与细胞生物学研究所化学生物学技术平台各位老师对本实验方法的帮助和改进。本实验得到国家自然科学基金项目 (31471342 and 31671408) 的资助。

参考文献

1. Yoo, S. H., Yamazaki, S., Lowrey, P. L., Shimomura, K., Ko, C. H., Buhr, E. D., Siepka, S. M., Hong, H. K., Oh, W. J., Yoo, O. J., Menaker, M. and Takahashi, J. S. (2004). PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A 101(15): 5339-5346.
2. Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H. and Liu, A. C. (2012). Monitoring cell-autonomous circadian clock rhythms of gene expression using luciferase bioluminescence reporters. J Vis Exp (67): e4234.