GoldCLIP：无胶纯化连接依赖的RNA测序技术
GoldCLIP: Gel-omitted Ligation-dependent CLIP   

研究背景

RNA结合蛋白 (RNA binding protein，RBP) 在调节RNA的定位、结构以及代谢等方面具有重要的作用，RNA结合蛋白功能的研究主要使用的方法是交联免疫沉淀技术 (Cross-Linking Immuno-Precipitation，CLIP)，然而传统的CLIP技术依赖于同位素³²P标记示踪RNA后进行转膜纯化RNA-P32/RBP复合物，极大地限制了CLIP技术的广泛使用。Promega公司研发的Halo标签因其能够与配体共价结合，具有极高的配体亲和力，为突破传统CLIP技术的局限提供了可能。

材料与试剂

1. 1.5 ml Eppendorf LoBind (Eppendorf, catalog number: 0030108116)
   
2. 2 ml Eppendorf LoBind (Eppendorf, catalog number: 0030108132)
   
3. 0.22 µm filter(Millipore，Catalog number: SLGV033RS)
   
4. Protease inhibitor cocktail (Promega, catalog number: G6521)
   
5. Micrococal nuclease (NEB, catalog number: M0247S)
   
6. Calf intestine phosphatase (NEB, catalog number: M0290S)
   
7. DNase I (Promega, catalog number: M6101)
   
8. RNase inhibitor (Promega, catalog number: N261B)
   
9. T4 RNA Ligase I (Ambion, catalog number: AM2141)
   
10. Trizol LS reagent (Invitrogen, catalog number: 10296028)
    
11. ATP (NEB, catalog number: P0756L)
    
12. DMSO (Sigma, catalog number: D8418)
    
13. Saturated phenol (Sigma, catalog number: P1037)
    
14. Glycogen (Ambion, catalog number: AM9510)
    
15. 3 M NaOAc pH 5.5 (Ambion, catalog number: AM9740)
    
16. Protease K (NEB, catalog number: P8102S)
    
17. SuperScript III reverse transcriptase (Invitrogen, catalog number: 18080093)
    
18. Halo Magne^® Beads (Promega, catalog number: G7281)
    
19. CircLigase II (Epicentre, catalog number: CK9025K)
    
20. 1 M Tris-HCl (Invitrogen, catalog number: 15568025)
    
21. 5 M NaCl (Invitrogen, catalog number: 24740011)
    
22. 0.1 M DTT (Thermo Scientific, catalog number: 707265ML)
    
23. CaCl₂ (Sigma-Aldrich, catalog number: 10035-04-8)
    
24. 10% Triton X-100 (Thermo Scientific, catalog number: R21902)
    
25. 50% Glycerol (Invitrogen, catalog number: 15514011)
26. EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free (Invitrogen, catalog number: AM9260G)
    
27. EGTA (Sigma-Aldrich, catalog number: 03777-10G)
    
28. Urea (Invitrogen, catalog number: 15505050)
    
29. 10%SDS (Invitrogen, catalog number: 15553027)
    
30. DNase/RNase-Free Distilled Water (Invitrogen, catalog number: 10977023)
    
31. TBE-Urea Sample Buffer (Invitrogen, catalog number: LC6876)
    
32. Halo Magne^® Beads (Promega, catalog number: G7281)
    
33. NEB CutSmart Buffer (NEB, catalog number: B7204S)
    
34. Glycogen (Invitrogen, catalog number: 10814010)
    
35. Phusion Master Mix (NEB, catalog number: M0531L)
    
36. Zymoclean Gel DNA Recovery Kit (Zymo，catalog number：D4008)
    
37. Lysis Buffer (see Recipes)
    
38. Dilution Buffer (see Recipes)
    
39. PBST Wash Buffer (see Recipes)
    
40. High-salt PBST Wash Buffer (see Recipes)
    
41. Urea Wash Buffer (see Recipes)
    
42. SDS Wash Buffer (see Recipes)
    
43. PNK Buffer (see Recipes)
    
44. TEV Reaction Buffer (see Recipes)
    

仪器设备

1. 10 cm Petri dish
   
2. Cell spatula
   
3. 15 ml tube
   
4. Pipettes
   
5. UVLink 1000 Crosslinker (Analytik Jena)
   
6. Centrifuge (Eppendorf, model: 5424R)
   
7. Thermomixer (Eppendorf, catalog number: 5382000023)
   

实验步骤

本方法首先需要构建表达带Halo标签的RBP (Halo-RBP) 的细胞系。之后，对活细胞内Halo-RBP/RNA复合物进行紫外交联并收集细胞。细胞裂解后，通过带有Halo配体的磁珠共价结合Halo-RBP/RNA复合物 (可适当片段化RNA)。再利用碱性磷酸酶去除RNA 3'末端的磷酸基团生成羟基，并通过Trizol试剂洗涤磁珠。随后，在RNA的3'末端加上接头，并通过变性洗脱去除非共价交联污染物。最后，通过Tev蛋白酶分离Halo标签和RBP/RNA复合物。降解蛋白纯化得到RNA，即可参照iCLIP²构建cDNA文库进行高通量测序 (图1)。相比于传统的CLIP技术，GoldCLIP不需要进行同位素标记，简化了实验步骤，节省了时间，为实验室研究RBP提供了新的技术方案。

图1. GOLD-CLIP技术流程图

一、构建Halo标签与目的蛋白融合的细胞系
Halo标签与目的RBP构建融合蛋白时不可以影响目的RBP的功能。因此，不同的RBP添加Halo标签之前先需要查阅相关文献，确定Halo标签能否位于目的RBP的N端或者C端，若无相关文献，建议分别构建Halo-RBP与RBP-Halo融合蛋白。同时需要构建表达Halo-YFP与YFP-Halo蛋白的细胞系作为对照。原则上，在目的RBP基因位点原位敲入Halo标签为最佳选择，此时Halo-RBP或RBP-Halo表达量为细胞内正常水平，结合的RNA最为接近真实情况。但也可对Halo-RBP或RBP-Halo在细胞系中进行过表达。本方法中使用过表达细胞系。利用逆转录病毒载体介导Halo-PTB基因随机整合至293细胞基因组上，抗性筛选构建稳定表达Halo-PTB蛋白的293细胞系，利用Western Blot 检测蛋白表达量，并进行免疫荧光染色实验 (图2)，进一步确认蛋白定位正常，进行下游实验。


图2. Halo标签与目的蛋白融合的细胞系

二、细胞UV交联

1. 取在10 cm直径培养皿中培养的贴壁细胞，弃去培养基，加入6 ml预冷的PBS溶液。
2. 放入UVP交联仪，在254 nm波长下进行以200 mJ/cm²能量进行UV照射交联，旋转培养皿180 °，照射交联第二次。
3. 加入少量预冷的PBS溶液，用细胞刮铲快速刮铲培养皿表面细胞，收集至15 ml离心管中，重复加入预冷的PBS溶液并收集，以1,000 × g在4 °C条件下离心。
4. 弃去上清，重新加入15 ml预冷的PBS溶液进行洗涤以1,000 × g在4 °C条件下离心。
5. 弃去上清与管壁残留液体，速冻于干冰中，转移至-80 °C冰箱保存至使用前。
   
   

三、裂解细胞并进行适当的微球菌核酸酶消化

1. 在冰上用1 ml预冷的Lysis Buffer重悬细胞并在冰上孵育10 min，可使用研磨器研磨20次帮助裂解核膜释放核内蛋白，研磨时请避免气泡产生。
2. 迅速放入37 °C水浴中孵育3 min进行微球菌核酸酶消化，迅速插入冰中，孵育时间可适当延长或缩短，视所需最终产物片段大小而定，若片段过长则延长时间，若片段过短则缩短时间。注意若消化时间过短，片段过长会降低后续连接反应效率。
3. 加入1 ml预冷的Dilution Buffer终止消化反应，微球菌核酸酶发挥功能需要Ca²⁺的参与，Dilution Buffer中的螯合剂能够捕获Ca²⁺从而终止微球菌核酸酶的功能。
4. 18,000 × g，4 °C离心10 min，转移上清至新的2 ml EP管中。
   
   

四、Halo-RBP蛋白捕获

1. 保留两份1/20的上清作为蛋白质的Input样品与RNA的Input样品。
2. 在上述2 ml EP管中加入预先用PBS溶液洗涤三次的50-200 μl的Halo Magne^® 磁珠，在4 °C旋转孵育过夜，Halo-RBP蛋白会与磁珠共价结合，若结合效率差则可追加常温孵育2 h。
3. 捕获结束后，保留一份1/20的上清作为蛋白质的unbound样品，将剩余上清用液氮速冻保存于-80 °C以防捕获效率低，若捕获效率低则可使用保留的上清进行二次结合或进行结合条件的测试。比较Input和Unbound样品Halo-RBP条带强弱来判断捕获效率，如图3所示。
   
   
   图3. Halo标签免疫沉淀的效率检测
   
   
4. 用1 ml High-salt PBST Wash Buffer将结合了Halo-RBP/RNA的磁珠转移至新的2 ml EP管中，并洗涤3次，再用PBST Wash Buffer洗涤两次。
   
   

五、去磷酸化和DNase I处理

1. 用1 ml 1x NEB CutSmart Buffer洗涤磁珠三次。
2. 向装有磁珠的EP管中加入80 μl CIP & DNase I MIX。
   CIP & DNase I MIX
   Volume      Component
   8 µl             10x NEB CutSmart Buffer
   8 µl             10 mM CaCl₂
   5 µl             Alkaline phosphatase, CIP
   5 µl             DNase I
   2 µl             RNase inhibitor
   52 µl           H₂O
   80 µl           Total
   转移EP管至Thermomixer中，37 °C孵育30 min，期间以1,000 rpm转速每静置孵育3 min震荡15 s。
3. 加入Trizol洗涤磁珠彻底去除CIP与DNase I。
4. 用Urea Wash Buffer洗涤磁珠3次。
5. 用PNK Buffer洗涤磁珠5次，并用PNK buffer转移磁珠至新的2 ml EP管中。
   
   

六、3' RNA linker连接

1. 向装有磁珠的EP管中加入40 µl Linker Mix。（序列见附录）
   Linker Mix
   Volume    Component
   2 µl           RNase inhibitor
   2 µl           3' RNA linker 50 pmol/µl
   36 µl         H₂O
   40 µl         Total
   
2. 向装有磁珠的EP管中加入55 µl Ligase Mix。
   Ligase Mix
   Volume    Component
   10 µl         10x T4 RNA Ligase I buffer
   10 µl         BSA (10 mg/ml)
   10 µl         ATP (10 mM)
   10 µl         DMSO
   10 µl         T4 RNA Ligase I
   5 µl           0.1 M DTT
   55 µl        Total
   转移EP管至Thermomixer中，16 °C孵育过夜，期间以1,000 rpm转速每静置孵育3 min震荡15 s。
   
   

七、变性洗涤

1. 用SDS Wash Buffer洗涤磁珠三次，每次洗涤65 °C下震荡5 min。
2. 用Urea Wash Buffer洗涤磁珠两次，每次洗涤室温下震荡5 min。
   
   

八、Tev酶酶切

1. 用TEV Reaction Buffer洗涤磁珠三次。
2. 每个样品加入300 µl TEV Reaction Buffer，2 µl RNase inhibitor，5 µl protease (5 µg/µl)，在Thermomixer中25 °C孵育3 h，期间以1,000 rpm转速每静置孵育3 min震荡15 s。
3. 将300 µl上清转移至新的1.5 ml EP管中并放置于冰上。
4. 吸取 30 µl (1/10) 上清和input (1/20)样品进行RBP对应抗体的Western Blot实验，用来检测Tev酶切割效率。Tev酶切后上清中WB条带比Input中条带小33 kD，即Halo标签的分子量。若Tev酶切后上清中WB条带清晰可见，与Input样品中条带亮度相仿或更亮则可进行蛋白降解纯化RNA。
   
   

九、纯化RNA

1. 向装有270 µl上清的1.5 ml EP中加入100 µl PK Mix
   PK Mix
   Volume   Component
   4 µl          5 M NaCl (50 mM final conc.)
   20 µl       1 M Tris (pH 7.0) (50 mM final conc.)
   8 µl         10% SDS (0.2% final conc.)
   8 µl         H₂O
   60 µl       PK (4 mg/ml in final conc.)
   100 µl     Total
   
2. 加入400 µl饱和酚和130 µl氯仿，震荡混匀，室温静置5 min，4 °C 18,000 × g离心10 min。
3. 取上清加入50 µl 3 M NaOAc (pH 5.5)，1 µl glycogen，500 µl无水乙醇和500 µl异丙醇，混匀放于-20 °C沉淀过夜。
   
   

十、逆转录

1. 4 °C 18,000 × g 离心30 min，用新配制的80%乙醇洗涤RNA两次，干燥，用8 µl水溶解RNA。
   
2. 转移8 µl RNA至PCR管，加入Primer Mix（序列见附录）。
   Primer Mix
   Volume   Component
   8 µl         RNA samples
   1 µl         RT primer (2 µM for CLIP samples and 5 µM for input samples)
   1 µl        10 mM dNTP
   10 µl      Total
   
3. 70 °C孵育5 min，迅速放置于冰上2 min。
4. 每个样品加入10 µl RT MIX:
   RT Mix
   Volume   Component
   4 µl          5x First-Strand buffer
   1 µl          0.1 M DTT
   1 µl          SuperScript III reverse transcriptase
   1 µl          RNase inhibior
   3 µl          H₂O
   10 µl       Total
   
5. 25 °C孵育5 min，42 °C孵育20 min，50 °C孵育60 min，降温至4 °C。
6. 将所有的逆转录产物合并在其一起，补水至350 µl，加入1 µl glycogen，50 µl 3 M NaOAc (pH 5.5)，混匀，加入1 ml无水乙醇，置于-80 °C沉淀2 h或放置于干冰上10 min。
   
   

十一、聚丙烯酰胺凝胶纯化cDNA

1. 4 °C 18,000 × g离心30 min，用80%乙醇洗涤cDNA两次，干燥，用5 µl水溶解cDNA。
2. 加入10 µl 2x TBE-Urea loading buffer，95 °C加热样品2 min，迅速放置于冰上。
3. 上样至6% TBE-Urea聚丙烯酰胺胶，180 V跑胶45 min，可对TBE-Urea聚丙烯酰胺胶进行预跑，注意上样前需要清理胶孔内析出物。
4. 切胶保留120-200 nt (H) 与85-120 nt (L) 条带，置于1.5 ml EP管内。加入500 µl TE Buffer，并用1 ml针筒内胶棒碾碎胶块。
5. 5置于Thermomixer中，以1,100 rpm在37 °C下震荡2 h。
6. 18,000 × g离心5 min，转移上清滤过0.22 µm滤膜，收集至新EP管中。
7. 向EP管中加入50 µl 3 M NaOAc (pH 5.5)，2 µl glycogen，1 ml无水乙醇，-20 °C沉淀过夜。
   
   

十二、cDNA环化与线性化

1. 4 °C 18,000 × g离心30 min，用新配置的80%乙醇洗涤cDNA两次，干燥，用5 µl水溶解cDNA。
2. 转移至PCR管中，加入5 µl Ligation Mix:
   Ligation Mix
   Volume   Component
   3 µl          H₂O
   1 µl         10x CircLigase Buffer II
   0.5 µl      50 mM MnCl₂
   0.5 µl      CircLigase II (Epicentre)
   5 µl         Total
   
3. 60 °C孵育1 h。
4. 加入Oligo Annealing Mix:
   Oligo Annealing Mix
   Volume    Component
   4 µl          10x CutSmart Buffer
   1 µl          10 µM cut -oligo
   35 µl        H₂O
   40 µl        Total
   
5. 95 °C孵育1 min，每20 s降低1 °C，直至25 °C。
6. 加入2 µl BamHI-HF，37 °C孵育30 min。
   
   

十三、文库扩增，纯化与NGS测序

1. 配置PCR Mix（序列见附录）
   Volume    Component
   20 µl         cDNA
   4 µl           P5/P3 Solexa Primer Mix (10 µM)
   76 µl         H₂O
   100 µl       Phusion Master Mix
   200 µl       Total (50 µl/well)
   
   PCR程序：
   98 °C 2 min
   98 °C 15 s，65 °C 30 s，72 °C 30 s扩增15-25个循环，需要进行循环数测试。
   72 °C 5 min
   16 °C forever
   
2. 低熔点琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，切胶选择150-300 bp产物回收。
   用Zymoclean Gel DNA Recovery Kit回收产物进行NGS测序，可使用Illumina HiSeq X10或者HiSeq2500平台进行PE150双端测序，文库类型为RNA-seq，每个样品测序数据量15 M足够，库检结果一般认定为小片段污染，对于CLIP文库而言，这是正常的，可风险上机。实验组与对照组均需要生物学重复。
   
   

十四、有效测序数据选取
测序数据使用FASTX Toolkit进行处理 (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit)。Cutadapt (v1.10) 去除3'接头序列。丢弃小于24 nt的数据。去除比到tRNAs，rRNAs和线粒体基因组上的数据。

十五、数据在全基因组的比对
将剩余的有效数据比对至人类基因组。在成功的CLIP文库中，unique mapping reads占75%以上。若unique mapping reads小于75%则大概率CLIP失败。我们将有效数据用bowtie程序进行比对，将测序读段回帖到人的基因组上 (hg19)，分析测序读段的分布情况。

十六、以Halo-PTB为例，展示其在PTBP1的结合信号 (图4)


图4. Halo-PTB在PTBP1 locus的结合信号

十七、UV交联位点基序分析 (图5)


图5. UVC和UVA交联位点的基序

溶液配方

1. Lysis Buffer
   50 mM Tris-HCl (pH 7.4)
   100 mM NaCl
   1 mM DTT
   2 mM CaCl₂
   1% Triton X-100
   10% glycerol
   1x protease inhibitor cocktail
   0.5 U/μl micrococal nuclease
   
2. Dilution Buffer
   50 mM Tris-HCl (pH 7.4)
   100 mM NaCl
   1 mM DTT
   2 mM EDTA
   2 mM EGTA
   10% glycerol
   1x protease inhibitor cocktail
   
3. PBST Wash Buffer
   PBS
   0.1% Triton X-100
   
4. High-salt PBST Wash Buffer
   PBS,
   500 mM NaCl
   0.1% Triton X-100
   
5. Urea Wash Buffer
   8 M urea
   
6. SDS Wash Buffer
   10% SDS
   50 mM Tris-HCl (pH 7.0)
   1 mM EDTA
   1 mM DTT
   0.1% Trition X-100
   
7. PNK Buffer
   20 mM Tris-HCl (pH 7.0)
   10 mM MgCl₂
   0.1% Triton X-100
   
8. TEV Reaction Buffer
   50 mM Tris (pH 8.0)
   1 mM EDTA
   1 mM DTT
   1% Triton X-100
   注：以上溶液均由DNase/RNase-Free Distilled Water配置。
   

致谢

感谢俞洋实验室各位工作人员与学生对本实验方法的帮助和改进。本实验得到国家自然科学基金项目的资助。本实验方案改编自Gu et al. (2018).

参考文献

1. Gu, J., Wang, M., Yang, Y., Qiu, D., Zhang, Y., Ma, J., Zhou, Y., Hannon, G. J. and Yu, Y. (2018). GoldCLIP: Gel-omitted Ligation-dependent CLIP. Genomics Proteomics Bioinf 16(2): 136-143.
2. Konig, J., Zarnack, K., Rot, G., Curk, T., Kayikci, M., Zupan, B., Turner, D. J., Luscombe, N. M. and Ule, J. (2011). iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution. J Vis Exp (50): e2638.

附录

表1. 本实验中设计到的引物具体序列


Halo标签序列：