KAPA建库试剂盒在通用方法学中的应用 下一代测序技术(NGS)，又称为大规模平行测序技术，通常指第二代和第三代测序技术，与一代测序技术相比，其在测序速度以及成本上的优势使得该技术在各个领域得以迅速应用。
按所测序核酸分子的类型不同，NGS文库类型可分为DNA 文库—全基因组测序 (WGS)、全外显子组测序 (WES)，染色质免疫沉淀测序 (ChIP-seq)；RNA文库—全转录组测序, RNA免疫沉淀测序 (RIP-seq)。KAPA NGS系列产品可覆盖所有类型文库构建应用。
二代测序技术被应用于各种起始样本中，而流式细胞分选和激光捕获显微切割技术的出现让在单细胞水平上研究细胞基因组及转录组异质性成为可能；目前该技术的发展逐渐成熟，已被广泛用于生命科学研究的各个领域。本文介绍了流式分选小鼠E7.5胚胎外胚层细胞后使用KAPA DNA HyperPlus构建全基因组文库，以分析各个胚层的甲基化、羟甲基化的水平。
研究背景
以往的研究对小鼠原肠胚期即E7.5时期，各个胚层的甲基化、羟甲基化水平并不明确，本实验的目标是在基因组水平上进行验证。同时利用全基因组测序与TAB-seq数据相对比，找出甲基化、羟甲基化主要在基因组、基因功能区域的变化及其可能作用。
生物材料：小鼠E7.5胚胎
起始总DNA量：~120 ng基因组DNA
实验目的
构建小鼠E7.5外胚层基因组文库，用于后期5hmC相关分析。
关键词：DNA，二代测序，纯化，单细胞
实验步骤
一、耗材及仪器准备
- 各型号枪头
- 各型号EP管
- 磁力架 (推荐使用DynaMag™-Spin magnet 6孔架，货号：12320D)
- 涡旋震荡仪
- 离心机
- PCR仪
- 流式细胞仪
- Nanodrop2000或Qubit
- 冰板－冷冻管模块 (2 ml)
二、试剂准备
- KAPA hyperplus试剂盒 (KK8510-8515)
- 无核酶水
- QIAGEN DNA Mini Kit
三、DNA提取
流式分选小鼠E7.5胚胎外胚层细胞，并利用QIAGEN DNA Mini Kit提取基因组DNA，用无核酶水洗脱DNA。Qubit测定DNA浓度 (5.98 ng/μl)。根据试剂盒建议，取20 μl即119.6 ng进行建库。
DNA提取全过程为3小时左右，提取后可于-20 ℃保存一个月，长期存放需要存于-80 ℃。
四、建库流程
注：
1) 全实验流程大概需要1.5~3 h。根据样品的数量，时间会有所不同。
2) 第一次使用前请仔细阅读KAPA HyperPlus说明书附录2；
3) 确定DNA是否含有EDTA；
4) 纯化磁珠建议提前拿出来放在室温半小时后再使用。
- 预冷PCR仪至4 °C
酶系打断
- 冰上配制反应体系：
20 μl
| DNA (119.6 ng DNA)
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15 μl
| 无核酶水
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5 μl
| KAPA Frag buffer
|
10 μl
| KAPA Frag Enzyme |
注: 本实验中提取的DNA 用无核酶水溶解，因此样品中不含EDTA。如样品中含EDTA时，将DNA样品体积调整为30 μl，并加入5 μl调节溶液(Conditioning Solution)。 - 枪头吹打混匀后，放于冰上，立即进行下一步。
- 在提前冷却至4 °C在PCR仪中，按照下面程序 进行设定 (体系50 μl，热盖45 °C)
4 °C
| 待PCR仪降温，时长与PCR性能有关
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37 °C
| 10 min (根据测序仪器需要300-400bp片段，于是根据说明书，选择350 bp，处理10 min)
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4 °C
| forever |
- 结束后将样本转入冰上，继续末端修复及加A尾。
末端修复及加A尾
- 在PCR管内按下表所示配制反应体系：
片段化后的DNA
| 50 μl
|
End repair& A-tailing buffe
| 7 μl
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End repair& A-tailing Enzyme mix
| 3 μl
|
总体积
| 60 μl |
注：建议准备冰盒和冰板，将buffer提前拿出在室温溶解，mix保持在冰板上，buffer溶解后管内会有各种盐离子沉淀，需要用枪头多次吹打混匀，保证buffer是澄清液体再使用。 - 将PCR管内液体充分混匀后轻微离心后放在冰板上，待进行下一步PCR加A。
- 按照下表设置PCR仪程序 (体系60 μl；热盖85 °C)
接头连接
- 溶解接头储液至15 μM (根据试剂盒说明书的表4，起始量250 ng选用15 μM的储液浓度) 。
- 在完成末端修复及加A反应的PCR管中配制以下反应体系：
完成加A反应的样品
| 60 μl
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15 μM adapter stock
| 5 μl
|
无核酶水
| 5 μl
|
Ligation buffer
| 30 μl
|
DNA ligase
| 10 μl
|
总体积：
| 100 μl
|
注：将Ligation buffer提前拿出在室温溶解，使用前用枪头多次吹打混匀，确保buffer是澄清液体再使用。 - 将PCR管内液体充分混匀后轻微离心后放在冰板上，开始PCR。
- PCR仪内20 °C 15 min (体系110 μl，热盖30 °C)
注：对于微量样品，建议加长连接时间 (20 °C 4 h或4 °C过夜)，增加连接时间有可能导致引物而具体，因此接头浓度需要自己调整和优化。 - 立即进行下一步：纯化。
连接后纯化
- 将样品转入1.5 ml管内用0.8X磁珠进行纯化：
Adapter连接后的样品
| 110 μl
|
KAPA Pure Beads
| 88 μl
|
总体积
| 198 μl
|
- 吹打混匀或用轻微涡旋。
- 室温下放置5~15 min保证样品和磁珠充分结合。
- 放于磁力架上，5 min后待样品管澄清。
- 小心吸弃上清。
- 将管子依旧放在磁力架上，向管中竖直加入200 μl 80%乙醇，不要碰到磁珠。
- 在磁力架上停留大于30 s。
注：按顺时针或逆时针旋转两次。 (保证磁珠和酒精充分接触) - 弃去酒精。
- 将管子依旧放在磁力架上，向管中竖直加入200 μl 80%乙醇。
- 在磁力架上停留大于30 s。
注：按顺时针或逆时针旋转两次。 - 弃去酒精，尽量吸净酒精，不要带走磁珠。
- 并在室温下放置3~5 min，晾干酒精。
注：吸弃酒精时尽量不碰到磁珠，晾干时注意磁珠不能太干 。 - 取下离心管。加入50 μl 无核酶水。(防止盐离子影响后续实验中酶及缓冲液的作用效果)
- 室温放置2 min将DNA溶解。
注：此处实验可暂停，但样品在4 °C保存不要超过24小时。
文库扩增
- 配制文库扩增体系：
KAPA HiFi Hot start ready mix (2×)
| 25 μl
|
KAPA library amplification primer mix (10×)
| 5 μl
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Adapter-ligated library
| 20 μl
|
总体积
| 50 μl
|
- 吹打混匀并轻微离心
- 按照下表的程序设置PCR仪
扩增后纯化
- 将样品转入1.5 ml管内用1× 磁珠按照下表进行配置：
文库扩增产物
| 50 μl
|
KAPA pure beads
| 50 μl
|
总体积
| 100 μl
|
- 吹打混匀或用轻微涡旋。
- 室温下5~15 min保证样品和磁珠充分结合。
- 放于磁力架，5 min后待样品管澄清；小心吸弃上清。
- 将管子放回磁力架上，向管中竖直加入200 μl 80%乙醇，注意枪头不要碰到磁珠。
- 在磁力架上停留大于30 s。
注：按顺时针或逆时针旋转两次。 - 弃去酒精。
- 将管子依旧放在磁力架上，向管中竖直加入200 μl 80%乙醇
- 在磁力架上停留大于30 s。
注：按顺时针或逆时针旋转两次。 - 弃去酒精，尽量吸净酒精，不要带走磁珠。
- 并在室温下放置3~5 min，晾干酒精。
- 取下离心管。加入50 μl无核酶水。
- 室温放置2 min将DNA溶解 (此处可以停止，并将样品存于4度不超过24小时)。
实验结果
文库扩增6个循环后，进行库检，达到上机测序的标准。
用户使用心得
本试剂盒使用简单易操作，末端补平及加A可同时进行。且加A及后续接头的连接可以一管完成，简单方便，非常适用于样品量比较低的样品。
<新用户使用建议>：1) 通读说明书，明确每一步中要用的体积和浓度后再进行试验，同时在下一步实验开始前做好规划，比如在PCR过程中，可以开始准备下一步的反应体系；2) 清洗磁珠时，管子应紧贴磁力架；3) 用酒精洗涤磁珠的过程中，注意枪头不要碰到磁珠，可能会粘走磁珠；4) 全过程使用进口的EP及PCR管。
对说明书的修改
溶解DNA均采用商品化的无核酶水。