流式细胞术检测细胞凋亡 (Annexin V/PI法)
Flow Detection of Apoptosis by Annexin V/PI   

材料与试剂

1. 5 ml流式管 (Falcon，catalog number: 352008)
2. 15 ml离心管 (Falcon，catalog number: 352097)
3. HeLa细胞
4. Annexin V-Alexa Fluor™488 (Invitrogen，catalog number: A13201)
5. PI碘化丙啶 (Sigma-Aldrich，catalog number: P4170)
6. NaCl 
7. Na₂HPO₄ 
8. KCl 
9. KH₂PO₄
10. H₂O₂
11. DEME培养基
12. HEPES
13. CaCl₂
14. PI染色工作液 (见溶液配方)
15. 1× Binding buffer (见溶液配方)
16. PBS (见溶液配方)
17. 800 μM H₂O₂ (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 水平离心机 (BeckmanCoulter, model: Allegra X-12R)
2. 光学显微镜 (Olympus, model: IX73)
3. 流式细胞仪 (FACSFortessa)
   

实验步骤

1. 染色前处理
   
   1.1

   将收集到的细胞，用预冷1× PBS (4 °C) 重悬一次，300 × g , 离心5分钟，弃上清，收集细胞。
   1.2

   加入300 μl的1× Binding Buffer重悬细胞，调整细胞浓度至1 × 10⁶/ml。
2. Annexin V/PI染色
   
   2.1

   取流式管，按顺序编好空白管，单阳管和样本管号。流式管中分别加入经200目细胞过滤膜过滤好的100 μl细胞悬液，单阳管中分别加入5 μl Annexin V-Alexa Fluor™488或10μl PI碘化丙啶轻轻混匀。
   2.2

   样本管加入5 μl Annexin V-Alexa Fluor™488轻轻混匀；再加入10 μl PI碘化丙啶轻轻混匀。
   2.3

   室温避光孵育10~20分钟，加入400 μl 1× Binding Buffer，随后置于冰浴中，上机检测，所选通道如下：
   Alexa Fluor™488：488 nm激发，采集波段530/30；
   PI：561 nm激发，采集波段610/20。

结果与分析

图1. 前向 (FSC) 和侧向 (SSC) 圈出HeLa细胞

图2. Annexin V/PI双标记HeLa细胞凋亡检测

如图1所示通过前向 (FSC) 和侧向 (SSC)，分别圈出的对照组和H₂O₂诱导组的HeLa细胞范围有所差别。诱导凋亡组的细胞已呈现出分群的趋势。图2为Annexin V/PI双标记的结果，如图2A所示对照组的HeLa细胞处于正常状态，但也有少许凋亡晚期的细胞，原因是培养的HeLa细胞浓度过高，导致培养基里的营养消耗过快，少许细胞因饥饿发生凋亡。图2B中显示，经H₂O₂诱导HeLa细胞出现了显著的早期凋亡现象，比例由1.06%增至7.43%；凋亡晚期的细胞比例呈明显增长趋势。综上可知，双标记方法可以准确地反映凋亡过程：Annexin V标记的单阳性细胞为凋亡早期细胞；Annexin V 与PI双标记的双阳性细胞为凋亡晚期细胞 (Koç,等，2018)；PI标记的单阳性细胞为坏死细胞；两者均未标记上的双阴性细胞为活细胞。由此将凋亡早期细胞、凋亡晚期细胞、坏死细胞与正常细胞区别开。因此，可作为检测细胞凋亡的首选方法 (Schutte等，1998) 。

注意事项

1. 使用前低速离心，以免液体积存管盖和管壁。
2. 如果用含EDTA的胰酶消化时，注意必须彻底清除EDTA：在标记前用1× PBS或 1× Binding buffer洗涤，清除EDTA，以免残余的EDTA与Ca2+螯合，影响Annexin V的结合。
3. Annexin V-Alexa Fluor™488和PI是光敏物质，在操作时请注意避光。在处理和标记时，尽可能在暗处进行。在孵育阶段，用铝箔包裹容器或置于抽屉中。细胞标记后，在暗室内用显微镜观察。
4. 整个操作过程动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞，尽量在4 °C下操作，以免影响细胞状态。
5. 在细胞洗涤的最后一步，请尽量将上清弃净，以免PBS残留，有可能会影响实验结果。
6. 为防止荧光衰变，宜在1小时内进行流式检测。
7. PI染色时间过长有可能造成检测的凋亡率偏高，建议首先进行Annexin V-Alexa Fluor™488染色，最短可在上机前5分钟再加入PI染色。

溶液配方

1. PBS
   NaCl          8 g
   Na₂HPO₄ 2.9 g
   KCl            0.2 g
   KH₂PO₄   0.2 g
   溶于1L ddH₂O中，调pH值为7.2~7.4
   过滤灭菌
   4 °C保存
2. 800 μM H₂O₂ 
   取30% H₂O₂ 2 μl溶于880 μl 1× PBS中，配成20 mM的母液
   再取80 μl母液溶于2 ml DEME培养基
3. PI染色工作液
   1 mg/mL PI原液+无菌PBS按1:10稀释成100 μg/ml工作液
   4 °C保存待用
4. 1× Binding buffer
   10 mM HEPES
   140 mM NaCl
   2.4 mM CaCl₂
   pH 7.4

参考文献

1. Koç, E. , Çelik-Uzuner, S., Uzuner, U. and Çakmak, R. (2018). The Detailed Comparison of Cell Death Detected by Annexin V-PI Counterstain Using Fluorescence Microscope, Flow Cytometry and Automated Cell Counter in Mammalian and Microalgae Cells. J Fluoresc 28(6): 1393-1404.
   
2. Schutte, B., Nuydens, R., Geerts, H. and Ramaekers, F. (1998). Annexin V binding assay as a tool to measure apoptosis in differentiated neuronal cells. J Neurosci Meth 86(1): 63-69.