果蝇脂肪组织高压冷冻-冷冻替代透射电镜 (HPF-FS TEM)
High Pressure Freezing-freezing Substitution Transmission Electron Microscope (HPF-FS TEM) of Drosophila Fat Tissue   

材料与试剂

1. 果蝇三龄幼虫
2. 液氮
3. 锇酸 (四氧化锇)
4. 丙酮
5. 醋酸双氧铀
6. Embed 812树脂
7. NaCl
8. KCl
9. Na₂HPO₄
10. KH₂PO₄
11. HCl
12. 1× PBS (见溶液配方)
13. 样品替代液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. Leica Microsystems HPM 100高压冷冻仪
2. Leica Microsystems AFS-2冷冻替代仪
3. Leica Ultracut UCT切片机
4. JEM-1400 TEM电子显微镜
5. Gatan832 4k × 2.7k CCD
6. 烘箱
   

实验步骤

1. 在1× PBS中解剖出来的三龄幼虫脂肪体进入Leica Microsystems HPM 100高压冷冻固定，并自动进入液氮。
2. 样品在液氮中被转移到替代液中并置入Leica Microsystems AFS-2冷冻替代仪 -90 °C孵育72小时。
3. 以8 °C每小时的速率升温到-60 °C并在此温度维持12小时。
4. 再次以5 °C每小时的速率升温到-30 °C并在此温度维持10小时。
5. 再升温至10 °C并维持10小时。
6. 用纯的丙酮将样品快速洗四次。然后用1%的醋酸双氧铀染色1小时，然后用纯丙酮洗三次。
7. 用Embed 812树脂梯度渗透，按丙酮对树脂比例2:1渗透3小时，1:1渗透5小时。然后用纯树脂渗透两次，每次8小时。
8. 将样品转移至新鲜纯树脂中，60 °C烘箱中包埋聚合3天。
9. 用Leica Ultracut UCT切片机进行超薄 (60 nm) 切片，并将切片收集排列于槽铜网格。
10. 用JEM-1400 TEM电子显微镜在80 kV下操作观察，用Gatan832 4k × 2.7k CCD采集图片 (Ding等，2018)。
    

溶液配方

1. 1× PBS
   137 mmol/L NaCl
   2.7 mmol/L KCl
   10 mmol/L Na₂HPO₄
   2 mmol/L KH₂PO₄
   用800 ml蒸馏水溶解8 g NaCl，0.2 g KCl, 1.44 g Na₂PHO₄和0.24 g KH₂PO₄
   用HCl调节溶液的pH值至7.4，加水至1 L
   分装后在15 psi (1.05 kg/cm²) 高压蒸汽灭菌20 min，或通过过滤除菌，保存至室温
2. 样品替代液
   2%四氧化锇及2%水用丙酮配制
   

参考文献

1. Ding, L., Yang, X., Tian, H., Liang, J., Zhang, F., Wang, G., Wang, Y., Ding, M., Shui, G. and Huang, X. (2018). Seipin regulates lipid homeostasis by ensuring calcium-dependent mitochondrial metabolism. EMBO J 37(17).