以MARCM标记单细胞在果蝇神经系统的应用
Labeling Single Cells by Mosaic Analysis with a Repressible Maker (MARCM) in Drosophila Nervous System   

材料与试剂

1. 500 μl微量离心管 (Eppendorf tubes) (Axygen, catalog number: MCT-060-C)
2. 载玻片 (SuperFrost^TM Microscope Slides, Ground 45°, 76 × 26 mm) (Thermo Scientific^TM, catalog number: 10281711)
3. 盖玻片 (cover glasses thickness No.1, 22 × 22 mm) (Marienfeld Superior, catalog number: 0101050)
4. 移液枪头 (移液枪配套使用) [Axygen, catalog number: 14-222-436 (1,200 μl), 14-222-437 (200 μl), 14-222-438 (10 μl)]
5. 培养皿 (Alpha Plus, 55 × 15 mm, catalog number: PP3-55)
6. 果蝇
7. 果蝇管 (信德仪器有限公司，catalog number: PT10-30100)
8. Embryo Collection Cage-Small (Genesee Scientific, Flystuff, catalog number: 59-100)
9. 透明指甲油 (露华浓经典指甲油，Revlon，catalog number: Vernis 771)
10. 葡萄果汁 (味全公司，每日C 100%葡萄综合果汁)
11. 琼脂 (agar) (GeneTeks, catalog number: WGT-PA001)
12. 二次过滤水 (ddH₂O)
13. 95%酒精 (景明化工股份有限公司)
14. 冰醋酸 (glacial acetic acid) (Sigma-Aldrich, catalog number: JT-9508)
15. 丙酸 (proprionic acid) (Sigma-Aldrich, catalog number: SI-P1386-1L)
16. CO₂ (板桥气体有限公司)
17. 活性干酵母发酵粉 (Red Star, active dry yeast)
18. 聚甲醛 (20% paraformaldehyde) (Electron Microscopy Sciences, catalog number: 15713-S) 
19. 10×磷酸盐缓冲生理盐水 (10× Phosphate buffered saline (PBS)) (UniRegion Bio-Tech, catalog number: UR-PBS001-1L) 
20. 山羊血清 (Normal Goat Serum) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, catalog number: 005-000-121)
21. Triton X-100 (Sigma-Aldrich, catalog number: X100)
22. SlowFade^TM Gold Antifade Mountant (Invitrogen, catalog number: S36936)
23. 1× PBS (磷酸盐缓冲生理盐水) (见溶液配方)
24. 4%聚甲醛/磷酸盐缓冲生理盐水 (见溶液配方)
25. PBST (3% Triton X-100/PBS; 1,000 ml) (见溶液配方)
26. 5%山羊血清 (Normal Goat Serum) (见溶液配方)
27. 第一抗体溶液 (见溶液配方)
28. 第二抗体溶液 (见溶液配方)

仪器设备

1. 镊子 (Dumont #5 Forceps) (Dumont Switzerland, catalog number: 11252-20)
2. 1,000 ml烧杯 (Pyrex, catalog number: 1000-1L)
3. 微量移液枪 (Pipetman) [Gilson, P1000 (F123602), P200 (F123601), P20 (F123600), P2 (F144801)]
4. 解剖显微镜 (Nikon, model: N-SMZ745)
5. 共轭焦显微镜 (Zeiss, model: LSM780)
6. 培养箱 (Firstek, model: RI-560)
7. 恒温水槽 (Firstek, model: B-102)
8. 3D旋转震荡器 (Digisystem, model: SR-100)
9. 4 °C冷藏柜 (JunYang, model: JR-2-1100)
10. 微波炉 (Panasonic, model: NN-ST340)

实验步骤

用来进行MARCM的果蝇必须具备以下几个元素：(1) GAL4及UAS-reporter (如UAS-GFP)，以用于标记要研究的细胞；(2) tubp-GAL80，以抑制GAL4在所有细胞的作用；(3) flippase recombinase (FLP) 及FLP recombination target (FRT)，在处于G2-M细胞周期细胞中，经由FLP作用在同源染色体的两个同向FRT位置而造成染色体互换，进而使GAL80只存于一个子细胞中，而另一个子细胞则因不带有GAL80，而使得GAL4可启动UAS下游基因的表达 (图1A)。一般最常用的FLP是利用热激 (heatshock) 以诱导hs-FLP之启动子 (promoter) 活化并表达FLP。
        本实验方法中，以果蝇第一型神经细胞谱系 (Type 1 cell lineage) 为例来说明MARCM克隆的类型。在发育过程中，每一细胞谱系会从单一一个神经母细胞 (neuroblast) 开始进行第一次细胞分裂，而产生1个神经节母细胞 (ganglion mother cell) 和1个新的神经母细胞。此神经节母细胞会再进行一次分裂而产生2个神经细胞 (neurons) 或产生1个神经细胞及1个神经胶质细胞 (glia)，而新的神经母细胞会再进行下一次分裂，而产生另1个神经节母细胞和新的神经母细胞 (图1B)。
        在细胞谱系持续进行细胞分裂时，FLP作用在不同的细胞会标记不同的株落。若FLP表达在神经节母细胞而造成同源染色体互换，此结果会使GAL80只表达于1个子细胞中，所以另一个子细胞中的GAL4就没有GAL80的抑制，因此将只有单一神经细胞被标记 (单细胞克隆；single-cell clone)。若FLP表达在神经母细胞而造成同源染色体互换，而GAL80则只表达于新的神经母细胞中，此时神经节母细胞的GAL4将没有GAL80抑制，因此可标记双细胞克隆 (two-cell clone)。同理，若是在神经母细胞分裂时表达FLP，而GAL80则只表达于神经节母细胞中，此时新的神经母细胞中的GAL4将没有GAL80抑制，因此可标记多细胞克隆 (neuroblast clone) (图1B-C) (Theodosiou和Xu, 1998; Lee和Luo, 1999; Wu和Luo, 2007)。


图1. MARCM原理. A. MARCM原理及示意图。GAL4作为转录因子，其会作用在结合位点UAS上，而启动其下游基因 (如GFP) 的表达。GAL80是抑制因子，其会抑制GAL4的活性而使其无法作用在UAS。在MARCM的方法中，母细胞带有GAL4，UAS-GFP，FRT及FRT tubp-GAL80 (A1) (Lee和Luo, 1999)。经过S细胞周期，染色体会复制形成2n (A2)。若在G2-M细胞周期时，诱导这个细胞表达FLP，随之FLP会作用在两个FRT序列上，使其发生基因重组 (A3) (Theodosiou和Xu, 1998; Wu和Luo, 2006)。细胞分裂后，其中一个子细胞可能不带有GAL80，因此其便可表达GFP (A4)。B. MARCM clone示意图。在果蝇的第一型细胞谱系 (Type 1 lineage)，神经母细胞 (Nb) 会分裂成神经节母细胞 (G) 和新的神经母细胞，而神经节母细胞会再分裂而产生2个神经细胞 (N)。若在神经节母细胞分裂前发生染色体互换，则其中一个子细胞可能不带有GAL80，故可检测到单细胞克隆 (single-cell clone，上图)；若在神经母细胞分裂前发生染色体重组，则会有两种可能：一是产生的神经节母细胞不带有GAL80，从而产生双细胞克隆 (two-cell clone，中图)，二是产生的神经母细胞不带有GAL80，从而造成多细胞克隆 (neuroblast clone，下图)。C. 共轭焦显微镜影像的果蝇大脑范例图。(上图) 单细胞克隆、(中图) 双细胞克隆、(下图) 多细胞克隆。D. 非MARCM clone范例图。(左图) 原始GAL4 (OK107-GAL4) 之表达；(右图) 标记细胞之数量与原GAL4相似 (详见结果与分析)。

一、葡萄汁琼脂盘制作

1. (以制备350 ml葡萄汁琼脂混合液为例) 将168 ml葡萄汁、160 ml二次过滤水和13.44 g琼脂倒入1,000 ml烧杯 (或烧瓶) 中，并置于微波炉中加热至溶解。
   注：必须分段加热，以防止液体瞬间沸腾而溢出烧杯。
2. 将混合液置于室温至稍微冷却后 (约75 °C)，加入3.5 ml 95%酒精、3.35 ml冰醋酸和1.75 ml丙酸，并用手轻微摇晃烧杯使其混合均匀。
3. 将混合液倒入培养皿中，每一培养皿加入约28 ml的混合液 (约可制备12个葡萄汁琼脂盘)。
4. 将葡萄汁琼脂盘置于室温冷却至凝固后即可以使用。未使用的的葡萄汁琼脂盘可用经二次过滤水沾湿的吸水纸将其包住，置于保鲜盒密封，并储存于4 °C冷藏柜，保存期限约1个月。
   
   

二、标记特定出生时间的神经细胞

1. 准备带有产生MARCM所需基因的果蝇：
   例如：将未交配过的雌果蝇 (UAS-mCD8GFP, hsFLP/FM6; FRTG13/CyO) 与雄果蝇 (FRTG13, tubp-GAL80/CyO; Elav-GAL4/TM6B, Tb) 交配，便可得UAS-mCD8GFP, hsFLP/+; FRTG13/FRTG13, tubp-GAL80; Elav-GAL4/+子代以用于MARCM实验。
2. 在果蝇管中洒入活性干酵母发酵粉后，放入约50只尚未交配的雌果蝇和10只雄果蝇，使其在25 °C培养箱交配约2~3天。果蝇的虫龄以0~7天为佳。
3. 第3天，将活性干酵母发酵粉洒在葡萄汁琼脂盘上并将果蝇移至组装好的Cage和琼脂盘 (图2B, 2C)，接着将整组置于25 °C培养箱，使果蝇在葡萄汁琼脂盘上产卵。
4. 放入培养箱16小时，以产出足够数量的卵 (其中多数仍为尚未孵化的卵)。之后将果蝇亲代用CO₂麻醉，并移至一组新的cage或果蝇培养管。在解剖显微镜下检查琼脂盘上是否有幼虫孵出，并用镊子将盘上已经孵出的幼虫 (图2C) 移除。再将此旧的琼脂盘与cage组好并置于25 °C培养箱。
5. (以设计收集12小时间出生的神经细胞为例) 距前次去除幼虫12小时后，将葡萄汁琼脂盘上已经孵出的幼虫用镊子挑至果蝇培养管中，此时幼虫的年纪范围为孵化后0~12小时 (0~12 h after larval hatching, ALH) (图2A, 2C)。将此带有幼虫的果蝇培养管置于25 °C培养箱。
6. (以透过MARCM标记在孵化后36~48小时出生之神经细胞为例) 在25 °C培养箱继续培养36小时，管中幼虫的虫龄为36~48 h ALH。此时将幼虫置于37 °C恒温水槽1小时 (图2A, 2C)。这个方法原则上会使幼虫所有细胞因热感应而表达Flipase。因为MARCM造成的染色体互换只会发生在处于G2-M细胞周期的细胞，故在此实验中被标记的神经细胞的出生时间为36~48 h ALH。
7. 若要标记孵化后12~24小时的幼虫之神经细胞，则在挑出0~12 h ALH的幼虫 (实验步骤5) 后，在25 °C培养箱继续培养12小时，再将培养管至于37 °C恒温水槽1小时以促使细胞表达Flipase。可以此类推欲标记出生时间的神经细胞 (图2A, 2C)。
8. 待温水浴后，将果蝇培养管放回25 °C培养箱，静待幼虫生长至成蝇。
   
   
   图2. 以MARCM标记特定时间出生的果蝇神经细胞的实验设计. A. 果蝇发育时间范例。本范例的时间间隔 (time window) 是12小时，从幼虫孵出后至成蝇羽化前共分成16个时间间隔，收集不同时间间隔的果蝇幼虫或蛹并诱导细胞表达FLP，便可能标记到在该时间间隔出生的神经细胞。B. Embryo Collection Cage的组装。(左图) 组装前零件的俯视图；(中图) 组装前Cage的侧面图及洒上活性干酵母粉的葡萄汁琼脂盘的俯视图，建议如图示的酵母粉密度并只洒在约1/3的面积；(右图) 组装后的侧面图。C. 标记特定时间出生的果蝇神经细胞实验流程图。星号 (*)：要去除之幼虫。白色箭头：还未孵化的卵。白色箭号：要收集至果蝇管之幼虫，此时收到的幼虫年龄为孵化后0~12小时。
   
   

三、果蝇大脑的免疫染色

1. 实验前新鲜配制4%聚甲醛/磷酸盐缓冲生理盐水 (4% paraformaldehye/PBS)，在 500 μl微量离心管中加入500 μl 4%聚甲醛/磷酸盐缓冲生理盐水，再将其置于碎冰上。 
2. 收集羽化后2~5天的成蝇，在新鲜配制的4%聚甲醛/磷酸盐缓冲生理盐水中进行解剖以获取成蝇的大脑，并将解剖出的成蝇脑立即放入冰上的微量离心管。此离心管在整个解剖过程中必须固定在碎冰上，以保持成蝇脑的新鲜程度。解剖完所有样本后，将离心管移至室温下，置于3D旋转震荡器水平均匀反应20分钟。
3. 用微量移液枪移除离心管中的聚甲醛，并在离心管中加入500 μl含0.3% Triton X-100的磷酸盐缓冲生理盐水混合溶液 (0.3% Triton X-100/PBS; PBST)。而后将此微量离心管置于3D旋转震荡器并在室温下均匀反应20分钟，以移除残留在果蝇大脑的聚甲醛。反应后将微量离心管中的PBST移除，并加入新的PBST再次清洗。重复以PBST清洗样品共3次。
4. 移除微量离心管中的PBST，并在离心管中加入400 μl 5%山羊血清 (normal goat serum)，置于3D旋转震荡器并在室温下反应30分钟，以降低抗体非专一性的结合。
5. 移除5%山羊血清，并在微量离心管中加入400 μl 第一抗体 (primary antibody) 溶液。将离心管置于冷藏柜中的3D旋转震荡器中，使样品在 4 °C均匀反应至少二个隔夜 (two overnights)。
6. 用微量移液枪移除离心管中的第一抗体溶液，再加入500 μl PBST，将离心管置于3D旋转震荡器并在室温下反应20分钟，以PBST清除残留以及未与抗原结合的抗体。反应后将离心管中的PBST移除，并加入新的PBST再次反应。前后共以PBST清洗样品3次。
7. 移除离心管中的PBST，并在离心管中加入400 μl第二抗体 (secondary antibody) 溶液。将离心管置于4 °C冷藏柜中的3D旋转震荡器中，使样品在4 °C均匀反应至少一个隔夜 (one overnight)。
8. 以微量吸管移除离心管中的第二抗体溶液，并在离心管中加入500 μl PBST，将离心管置于3D旋转震荡器并在室温下反应20分钟，以PBST清除残留以及未与抗原结合的抗体。反应后将离心管中的PBST移除，并加入新的PBST再次反应。前后共以PBST清洗样品3次。
9. 移除离心管中的PBST后，在离心管中加入SlowFade^TM Gold Antifade Mountant以降低荧光褪色速度。将样品至于4 °C冷藏柜至少一个隔夜，以使Antifade Mountant与组织中的PBST得以充分置换。 
10. 将盖玻片 (cover glasses thickness No.1, Marienfeld Superior) 压碎成0.5 × 0.5 mm的碎片，将一200 μl微量吸管 (yellow tip) 的尖端剪掉，再以此微量吸管将果蝇的脑连同少量Antifade Mountant从离心管中吸出，置于以酒精清洁过的载玻片上，并在样本周围四个角落以碎盖玻片作为支撑，使盖玻片覆盖样本时不会挤压到果蝇的大脑。最后以指甲油密封盖玻片的外围。
    

结果与分析

1. MARCM clones的判读
   在幼虫被置于37 °C恒温水槽1小时的时间断内，并非所有的细胞皆处于G2-M细胞周期，因此相较于只以GAL4标记神经细胞的大脑，在带有MARCM clones的大脑中，表达GAL4的神经细胞数量应该会少非常多。最常见的二种异常情况为：
   1)

   所有大脑样品皆没有标记到任何细胞：此情形常因为果蝇未带有FLP, FRT, GAL4或UAS-reporter中任一项或数项。然而，也有可能是在37 °C恒温水槽1小时的培养时间太短，而不足以促使足够的FLP表达，或是置于37 °C恒温水槽的时间点未涵盖到欲观察的细胞进入G2-M的时间。
   2)

   标记的神经细胞的数量与GAL4表达相似 (图1D)：此情形常因果蝇未带有tubp-GAL80。
2. 三种类型MARCM clone机率 (clone frequency) 的计算
   1)

   通过计算某一特定类型clone的发生机率，可推算果蝇神经发育过程中的不同时间点，神经母细胞或神经节母细胞的分裂速度，以及神经细胞的产生速度。例如幼虫孵化后12~24小时，假设其出现单细胞克隆的机率相较于其它时间点较低，且多细胞克隆出现的机率较高，则可推测12~24小时这段时间内神经节母细胞可能处于不分裂的状态，因而标记单细胞克隆的机率较低。以下说明计算三种clone发生机率的方法：以单细胞克隆的发生机率为例，以半脑 (单侧的大脑) 为单位，clone发生机率 = (带有单细胞克隆的半脑数)/(总样本半脑数)。
   2)

   当FLP表达在神经母细胞而造成染色体重组时，其结果会使GAL80只表达于产生的神经节母细胞或新的神经母细胞，理论上这样的机率是50:50。因此，双细胞克隆和多细胞克隆的clone发生机率理论上应该会一样或相近。

失败经验

使用的抗体的组合及浓度必须事先测试，否则可能会因免疫荧光染色状况不佳，而误判为没有MARCM 克隆，或是导致不能观察到GAL4表达较少的克隆的情形。

溶液配方

1. 1× PBS (磷酸盐缓冲生理盐水)
   用二次过滤水稀释10× PBS至1× PBS，可放置于室温，一般可储存数个月，但视环境而异
2. 4%聚甲醛/磷酸盐缓冲生理盐水
   以1× PBS稀释20%聚甲醛至4%聚甲醛溶液，放置于碎冰上，使用当天配制
3. PBST (3% Triton X-100/PBS, 1,000 ml)
   3 ml Triton X-100
   100 ml 10× PBS
   897 ml二次过滤水
   须充分搅拌均匀，一般可放置于室温数月，但会因环境而异，必须注意是否有霉菌生长，一但发现霉菌，必须立即丢弃
4. 5%山羊血清 (Normal Goat Serum)
   以1× PBST稀释normal goat serum至5%，放置于碎冰上，需于使用当天配制
5. 第一抗体溶液
   用5%山羊血清 (溶液配方 4) 稀释第一抗体至特定浓度 (每种第一抗体适合的浓度不同)，放置于碎冰上，使用当天配制
6. 第二抗体溶液
   以1:500用PBST稀释，放置于碎冰上，使用当天配制

致谢

本研究方法首先于Lee和Luo (1999) 描述。感谢蔡国鼎与刘南甫于本文撰写过程所提供的宝贵建议。本研究方法是由中央研究院前瞻计划 (AS-102-CDA-L02) 经费支持。本研究方法无任何利益冲突或竞争性利益。

参考文献

1. Lee, T. and Luo, L. (1999). Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron 22(3): 451-461.
2. Theodosiou, NA and Xu, T. (1998). Use of FLP/FRT system to study Drosophila development. Methods 14(4): 355-365. 
3. Wu, J. S. and Luo, L. (2006). A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nat Protoc 1(6): 2583-2589.