果蝇肠上皮干细胞谱系示踪
Lineage Tracing in Drosophila Intestinal Stem Cells   

材料与试剂

1. 耗材
   
   1)

   1.5 ml离心管
   2)

   移液枪头
2. 果蝇品系
   
   1)

   Su(H)-Gal4 (from Steven Hou lab)
   2)

   u-Flp (BDSC: #4540)
   3)

   Tub-gal80^ts (BDSC: #7017)
   4)

   ttk-RNAi (v10855)/CyO
   5)

   Act [<<]lacZ /MRS (BDSC: #6355)
3. 试剂
   
   1)

   NaCl
   2)

   KCl
   3)

   Na₂HPO₄
   4)

   KH₂PO₄
   5)

   37%甲醛 (Sigma-Aldrich, catalog number: F1635)
   6)

   正庚烷 (国药集团化学试剂有限公司，80066992)
   7)

   甲醇 (Sigma-Aldrich, catalog number: 061495)
   8)

   Triton X-100 (Sigma-Aldrich, catalog number: T9248)
   9)

   NGS (Cell Signaling Technology, catalog number: 5425)
   10)

   甘油 (Sigma-Aldrich, catalog number: T9248)
   11)

   DAPI (Molecular Probe)
   12)

   一抗：小鼠源抗Dl (1:300, DSHB), 小鼠源抗Pros (1:300, DSHB), 兔源抗LacZ (1:300, DSHB)
   13)

   二抗：山羊抗兔Alexa488 (1:300, Molecular Probe), 山羊抗小鼠Alexa56 (1:300, Molecular Probe)
   14)

   1× PBS缓冲液 (见溶液配方)
   15)

   PBT缓冲液 (见溶液配方)
   16)

   Mounting Medium (见溶液配方)

仪器设备

1. 体式显微镜 (Leica S6E)
2. 移液枪 (吉尔森公司)
3. 精细解剖镊 (WPI, Dumoxel合金镊子，#5 14098)
4. 摇床 (杭州米欧仪器有限公司)
5. 激光共聚焦显微镜 (尼康公司，Nikon A1-R)
6. 恒温培养箱 (上海一恒科技有限公司)
   

实验步骤

本实验方法实验原理图 (见图1)。


图1. 细胞谱系追踪系统. 特定细胞中表达的Gal4驱动转座酶 (Flippase, Flp) 的表达,进而诱导终止子两端FRT序列进行同源重组，除去终止子，启动lacZ报告基因表达，标记相应细胞及其子代细胞 (改变自Evans等，2009)。
  

1. 分别取10只基因型为ttk-RNAi(v10855)/CyO；Act[<<]lacZ，Tub-gal80^ts/MRS (实验组) 和Act[<<]lacZ，Tub-gal80^ts/MRS (对照组) 的雄果蝇，与40只基因型为Su(H)-Gal4；u-Flp，Tub-gal80^ts的处女雌果蝇，于18 °C培养箱中进行杂交。
2. 约25天后，收取无平衡染色体表型的F1代雌果蝇，每个cross收取10~15只，转移至29 °C温箱中培养，每隔两天传一次 (温度敏感性Gal80，在18 °C时可以有效抑制Gal4的活性，阻止转座酶(Flp)的表达；29 °C下，Gal80失活，转座酶表达并激活同源重组)。
3. 29 °C培养7天后，体视显微镜下，在预冷的1× PBS中剖出果蝇中肠，并将其转入装有500 μl预冷1× PBS的1.5 ml离心管内。
4. 对解剖出来的果蝇肠道进行固定，脱水，免疫荧光染色及制片,详细步骤参见“果蝇肠上皮的免疫荧光染色” (金真和袭荣文，2019)。
5. 激光共聚焦显微镜40倍镜下观察，拍摄图像，分析带有LacZ谱系标记的细胞类型。
   

结果与分析

DAPI作为一种常用的DNA染料，可以标记出肠上皮细胞核的形态。其中，肠道干细胞，肠道前体细胞以及内分泌细胞都是二倍体的小核细胞，而肠吸收型细胞是多倍体的大核细胞。Delta是Notch信号通路的配体，特异性的表达于干细胞表面；而Pros是肠内分泌细胞特异性表达的一种转录因子，分布于细胞核中。LacZ作为谱系追踪的标记物，标记出前体细胞所产生的所有子代细胞。
        在正常情况下，Notch信号激活的前体细胞，其最终将分化成为肠吸收型细胞，而不会产生分泌型细胞。因此，对照组中，LacZ标记的细胞绝大多数是单个的大核细胞，而Pros⁺的肠内分泌细胞则都不带有LacZ标记 (图2A)。而在实验组中，产生了大量带有谱系标记的小细胞聚集，染色结果显示这些小细胞绝大部分是Pros⁺的 (图2B)。因此，在前体细胞中敲低ttk，可以有效的改变前体细胞终末分化的方向，由分化为肠吸收细胞变为肠内分泌细胞。


图2. 野生型及ttk敲低状态下，前体细胞的谱系追踪. A. 野生型肠道中，带有谱系标记的绝大多数是大核细胞. B. 敲低ttk后，带有谱系标记的绝大多数是Pros⁺的小核细胞。标尺：20 μm。

注意事项

1. 成功的谱系追踪，其前提是高度特异性在特定某一细胞类型中表达的Gal4，否则很容易产生leaky。
2. 谱系追踪系统非常敏感，18 °C培养时即使有低水平的Gal4活性也能诱导lineage标记产生，因此最好有多个Gal80元件，抑制其在发育时期的表达。
   

溶液配方

1. 1× PBS缓冲液
   称取8 g NaCl，0.2 g KCl，1.42 g Na₂HPO₄，0.27 g KH₂PO₄，加水定容至1L，调节pH至7.4
   
2. PBT缓冲液
   向1 L 1× PBS缓冲液中加入1 ml Triton X-100，充分搅拌摇匀
   
3. Mounting Medium
   向70 ml 100%甘油中加入1× PBS缓冲液，至终体积为100 ml，充分混匀
   

致谢

本实验室的工作得到北京生命科学研究所及国家“973”项目的支持。该实验方案改编自本实验室已发表的文章(Wang等，2015)。

参考文献

1. 金真, 袭荣文. (2019). 果蝇肠上皮的免疫荧光染色. Bio-101 e1010270. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010270. 
2. Evans, C. J., Olson, J. M., Ngo, K. T., Kim, E., Lee, N. E., Kuoy, E., Patananan, A. N., Sitz, D., Tran, P., Do, M. T., Yackle, K., Cespedes, A., Hartenstein, V., Call, G. B. and Banerjee, U. (2009). G-TRACE: rapid Gal4-based cell lineage analysis in Drosophila. Nat Methods 6(8): 603-605.
3. Wang, C. H., Guo, X. T., Dou, K., Chen, H. Y., and Xi, R. W. (2015). Ttk69 acts as a master repressor of enteroendocrine cell specification in Drosophila intestinal stem cell lineages. Development: 142(19): 3321-3331.