果蝇组织免疫组织化学
Immunohistochemistry of Drosophila Tissues   

材料与试剂

1. 培养皿
2. 载玻片
3. 盖玻片
4. 雌性果蝇成虫
5. Grace’s Insect Medium
6. 4%多聚甲醛 (paraformaldehyde, PFA)
7. PBS (10×) (Beyotime, ST476)
8. Triton^TM X-100
9. 马血清
10. 一抗 (特异性结合目标蛋白)
    
    1)

    兔抗c-Myc
    2)

    山羊抗CTP合成酶 (CTP synthase, CTPS)
11. 二抗 (带有荧光基团，特异性结合一抗)
    
    1)

    Texas Red狗抗山羊IgG
    2)

    Cy5狗抗兔IgG
12. DNA荧光染料: Hoechst 33342
13. 凡士林
14. 指甲油
15. 磷酸缓冲液 (1× PBS) (见溶液配方)
16. PST (1×) (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 镊子
2. 解剖显微镜 (OLYMPU SZ61)
3. 移液器
4. 激光扫描共聚焦荧光显微镜 (Leica SP5II或者SP8)
5. 果蝇二氧化碳麻醉工作站
   

实验步骤

一、组织解剖和固定

1. 在饲养果蝇的容器中通入二氧化碳使果蝇麻醉，将果蝇倒出，置于表面通有二氧化碳的垫板上，挑选雌性果蝇。
2. 在培养皿中倒入Grace’s Insect Medium，将果蝇置于液体中。用镊子轻轻固定住果蝇腹部的前部，用另一把镊子夹住果蝇腹部的倒数第二个体节，并将这部分从果蝇身体上扯下，卵巢会被一起扯出 (图1)。尽快将卵巢转移至新的培养皿中，卵巢上附着的组织将会在后续步骤中被清除。
   注：
   
   1)

   解剖和固定在室温下进行，试剂应在从冰箱拿出后放至室温后再使用。
   2)

   可使用移液器进行转移，在转移之前剪去移液管顶部的一部分使其能吸入卵巢大小的组织。如果组织容易粘在管壁上，可以先在新的培养皿中滴入一滴Grace’s Insect Medium，将镊子夹在组织不易破损或者对于实验不重要的部分，轻轻夹起组织，置于新培养皿的液滴中，放下组织。
   
   
   图1. 解剖果蝇卵巢示意图. A. 用镊子轻轻固定住果蝇腹部的前部，用另一把镊子夹住果蝇腹部的倒数第二个体节。B. 左手镊子固定果蝇身体，右手镊子将果蝇尾部两个体节轻轻拉出，卵巢会被一起扯出。这时不必对解剖组织进行清理，迅速开始解剖下一只果蝇。左撇子的拿镊子解剖方式与此呈镜像对称。
   
   
3. 使用移液器尽可能多的移去组织周围的Grace’s Insect Medium。
4. 使用移液器在组织上滴加200 μl 4% PFA，使组织浸没在液滴中。在室温下静置固定10分钟。
5. 使用移液器尽可能多的移去卵巢周围的PFA。
6. 加入2 ml PBS，轻轻摇晃培养皿，洗去残留的PFA，移去PBS。一次即可。
7. 加入PST，在解剖显微镜下去除卵巢周围附着的其他组织。
8. 将卵巢使用移液器转移至600 μl离心管中，加入400 μl PST，储存于4 °C或立即用于接下来的实验。
   注：根据组织和固定情况的不同，组织的有效的保存时间会有较大差异。为了取得最佳的染色效果，尽量使用新鲜制备的样品。

1. 使用PST稀释抗体原液，按比例配制20 μl体积的一抗溶液，使得一抗最终稀释比例在1:200至1:1,000之间，或者是抗体终浓度为1 μg/ml。
   注：在本示例中一抗 (兔抗c-Myc，山羊抗CTPS) 的稀释比例为1:200，一抗的浓度应根据具体情况进行调整。
2. 将两对固定好的卵巢使用移液器转移至新的600 μl离心管中。
   注：卵巢属于相对较大的组织，一般在20 μl的抗体溶液中加入2对卵巢。在抗体浓度相同的情况下，样品越少染色效果越好。
3. 使用移液器尽可能多的移去卵巢周围的液体。
4. 加入20 μl一抗溶液。
5. 室温孵育过夜。
   注：一抗最佳孵育时间与温度和样品的情况有关，一般一抗孵育不超过一天。
6. 使用PST稀释并配制二抗溶液，使得二抗最终稀释比例在1:200至1:1,000之间。加入DNA染料 (DAPI或Hoechst，稀释比例1:1,000)，总体积为20 μl。
   注：本示例中二抗 (Texas Red狗抗山羊IgG; Cy5狗抗兔IgG)的稀释比例为1:250，Hoechst 33342的终浓度为1 μg/ml。二抗和DNA染料的浓度应根据具体情况进行调整。
7. 使用移液器尽可能多的移去卵巢周围的一抗溶液。
8. 使用移液器加入200 μl PST，轻轻吹打，洗去残留的一抗，移去PST。
   注：如果样品成像时背景信号较强，可多次重复这一步。
9. 加入20 μl二抗溶液。
10. 室温孵育过夜。
    注：
    
    1)

    二抗最佳孵育时间与温度和样品的情况有关，如果样品成像时信号较弱，可以选择延长二抗孵育时间至两天或更长。

    2)

    如需储存，可以在二抗孵育过夜后将样品继续放在二抗溶液中在4 °C保存。保存时间过长会导致较强的背景信号。

1. 在纸巾上放置一片盖玻片。
2. 在盖玻片的四角涂上凡士林
3. 使用移液器将卵巢和15 μl左右的二抗溶液一起转移至盖玻片上。
   注：在二抗溶液浓度合理的情况下，不需要洗去二抗。
4. 将载玻片轻压在盖玻片上，使盖玻片通过凡士林粘在载玻片上，翻转载玻片，使盖玻片在上，置于纸巾上。
5. 使用移液管轻压盖玻片的四角，使四角的高度尽量相同，赶出载玻片和盖玻片之间的气泡。
6. 如有液体溢出，轻轻用纸巾吸去。
7. 使用指甲油密封盖玻片的四边。
8. 待指甲油晾干后，可使用荧光显微镜或共聚焦荧光显微镜进行成像。
   注：在制片完成后应尽快进行成像。如果无法及时进行成像，应如免疫组化染色 (8) 中所述保存在二抗溶液中，在成像之前再取出制片。

注意事项

一、信号弱或无信号

1. 二抗与一抗不匹配
   选用与一抗来源物种相对应的二抗
2. 一抗或二抗浓度过低
   适当增加抗体浓度
3. 抗体孵育时间过短
   适当增加抗体孵育时间和温度
4. 抗体储存出现问题，导致抗体失效
   配制新的抗体溶液
5. 在一管抗体中孵育的样品量过多
   减少每管的样品数量
6. 样品储存时间过长，或在室温中放置的时间过长
   尽量使用新鲜的样品

1. 一抗或二抗的浓度过高
   适当降低抗体浓度
2. 孵育时间过长
   适当减少孵育时间，或降低温度
3. 更换抗体时未洗净一抗
   在更换抗体时增加洗涤次数
4. PST中的血清出现沉淀或变质，导致封闭效果不佳
   配制新的PST
5. 制片后长时间未进行成像
   制片后尽快进行成像
6. 二抗所带荧光基团的吸收/激发波长相近，在成像时出现串扰
   在进行多个抗体的染色时，注意选择荧光基团吸收/激发波长相距较远的二抗
7. 指甲油未完全密封盖玻片，样品出现干片
   在指甲油干燥后确认已经密封，如未密封可以再涂一层指甲油

1. 样品固定不充分；保存时间过长；或在室温中放置时间过长，导致组织溃散
   尽量使用新鲜的组织。如果组织保存时间较长导致液体中有组织脱落的碎片，可以在孵育抗体之前用新鲜的PST清洗一遍
2. 抗体溶液或PST等试剂中血清出现沉淀
   使用新鲜配制的试剂，或者在使用前离心，取上清液用于实验

结果与分析

核苷酸CTP的从头合成的限速反应由CTPS催化。我们之前的工作表明，CTPS在果蝇卵巢里的细胞以及其他组织中可以形成蛇形的细胞内结构，我们把这种结构称为细胞蛇 (英文单数是cytoophidium；复数是Cytoophidia) (Liu, 2010)。
       在寻找CTPS组装成细胞蛇的因子研究中，我们发现原癌基因Myc表达量对细胞蛇的形成有影响。因此，我们利用果蝇遗传手段，以果蝇卵巢中的单层上皮细胞滤泡细胞作为研究模型。细胞核中的GFP表明该细胞中Myc会因为RNA干扰而表达水平降低。对此，我们在解剖果蝇获得卵巢，并进行固定之后，同时用两种一抗 (兔抗c-Myc，山羊抗CTPS) 与样品孵育，室温过夜。
第二天把一抗用PST溶液清洗一遍。然后向装有样品的小管中同时加两种二抗 (Texas Red狗抗山羊IgG; Cy5狗抗兔IgG)，并且加入DNA荧光染料Hoechst 33342，孵育，室温过夜。次日可以制片用激光扫描共聚焦显微镜拍照。
       由于我们所用的四个不同染料 (Hoechst 33342，GFP，Texas Red和Cy5) 的激发光和收集光光谱均有不同，这样我们可以在激光扫描显微镜下开通四个通道，同时检测DNA和三种蛋白质 (GFP，CTPS和Myc) (图2)。这样我们就可以清晰并且直接的观察到，在Myc被敲低的细胞里 (GFP阳性)，Myc的免疫染色几乎没有 (图2D)。与之对比的是对照细胞 (GFP阴性) 里Myc免疫染色信号在细胞核里很明显 (图2D)。对应的是，Myc蛋白水平高的细胞 (GFP阴性) 里CTPS可以形成纤维状细胞蛇 (图2C)，而Myc蛋白水平低的细胞 (GFP阳性) 里则看不到CTPS组成的细胞蛇(图2C)。这种多组分相互关系可以用不同色彩在叠加图中展示 (图2E)。因此，这个免疫组织化学的结果支持Myc对CTPS组装成细胞蛇有调控作用 (Auguey等，2016)。


图2. 原癌基因Myc影响CTP合成酶 (CTPS) 形成细胞蛇. 果蝇卵巢里单层卵泡细胞中的部分细胞 (其细胞核在图B中显示为GFP阳性) 中的Myc (图D) 被RNA干扰敲地低，从而使得CTPS (图C) 不能组装成细胞蛇。图A显示细胞核DNA。图E是A-D四个通道的叠加图。

溶液配方

1. 磷酸缓冲液 (1× PBS)
   使用去离子水稀释PBS (10×) (Beyotime ST476) 至1×
2. PST (1×)
   1× PBS
   0.3% Triton^TM X-100
   0.5%马血清
   

致谢

刘冀珑实验室的工作得到上海科技大学，英国牛津大学以及英国医学理事会的支持。本文实验方案改编自本实验室的发表文章Tastan和Liu (2015) 和Aughey等 (2016).

参考文献

1. Liu, J. L. (2010). Intracellular compartmentation of CTP synthase in Drosophila. J Genet Genomics 37: 281-296.
2. Tastan, O. Y. and Liu, J. L. (2015). Visualizing cytoophidia expression in Drosophila follicle cells via immunohistochemistry. Methods Mol Biol 1328: 179-189.
3. Aughey, G. N., Grice, S. J. and Liu, J. L. (2016). The interplay between Myc and CTP synthase in Drosophila. PLOS Genet 12(2): e1005867.