果蝇成蝇脑原位杂交实验方案
In situ Hybridization in Adult Drosophila Brain   

材料与试剂

一、实验器具

1.  一次性耗材
   离心管50 ml，10 ml
   一次性枪头1,000 μl，200 μl，100 μl，10 μl
   保鲜膜
   小圆片 (Zweckform Verstaerkungsringe, catalog number: 3510)
   铝箔纸
2. 孵育器皿
   48孔细胞培养板 (Cellstar, catalog number: 677180)
3. 解剖器具
4. 玻片：20 mm × 40 mm，厚度小于20 μm
   玻片首先用浓硫酸浸泡过夜，用大量去离子水清洗，再用RNase free水冲洗3遍，放在脱色架上，60 °C烘干，用锡箔纸包好，室温保存备用。使用时用玻璃刀从中间划分为两半，即20 mm × 20 mm的大小作为载玻片。同时用玻璃刀把20 mm × 40 mm的玻片平均分成3份，即20 mm × 13 mm大小的作为盖玻片
   
   1)

   解剖用塑料培养皿 (直径55 mm)：其底部要铺一层胶 (Dow Corning, catalog number: Sylgard^® 184)，这样可避免镊子尖碰到底部时被弄弯
   2)

   培烧皿 (直径约4厘米带有磨口的盖子)：内装少量脱脂棉，并倒入少许75%的酒精。在解剖时当镊子尖端附着组织时，可以轻轻把镊子在酒精棉上擦拭，把镊子尖端的组织去掉
   
   

1. 甲醛
2. Glycerol
3. 指甲油
4. KCl
5. Na₂HPO₄•12H₂O
6. KH₂PO₄
7. NaOH
8. Tween-20 (Sigma, catalog number: P1379)
9. Triton X-100 (ICN Biomedicals, catalog number: 58404)
10. 浓盐酸
11. RNase AWAY (Invitrogen, catalog number: 7491543)
12. Bovine serum albumin (BSA) (华美Sino-American Biotec BP 0042)
13. Ficoll^TM (华美Sino-American Biotec BIO 322)
14. PVP (华美Sino-American Biotec BR 2205)
15. NaCl (北京精细化工有限公司)
16. 柠檬酸钠 (北京精细化工有限公司)
17. Formamide (Amresco, catalog number: 1167B35)
18. Torula RNA (Type IX) (Sigma, catalog number: R3629)
19. Sonicated salmon sperm DNA (Stratagene, catalog number: 201190)
20. CHAPS (Sigma, catalog number: C3023)
21. Heparin (Sigma, catalog number: H3125)
22. MgCl₂
23. Levamisol, an inhibitor of endogenous phosphatase (Sigma, catalog number: L9756)
24. 羊血清原液 (中杉金桥, catalog number: ZL1-9021)
25. DMF (Dimethylformamide, 二甲基甲酰胺) (防化学院化工厂)
26. NBT (硝基四氮唑蓝) (Amresco, catalog number: E1181)
27. BCIP (5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸) (Amresco, catalog number: E1041)
28. EDTA (Amresco, catalog number: 0322, MW = 292.25)
29. Tris (Amresco, catalog number: 0497, MW = 121.14)
30. RNase A (BBI, catalog number: RB0473)
31. 封闭剂 (Blocking Reagent) (Roche, catalog number: 11096176001)
32. Anti-Dig-AP抗体 (Roche, catalog number: 11093274910)
33. 甘油 (汕头市西陇化工有限公司)
34. RNase free水 (见溶液配方)
35. 10× PBS (pH = 7.4) (见溶液配方)
36. PTw (见溶液配方)
37. PTX (见溶液配方)
38. 0.5 M EDTA (见溶液配方)
39. 1 M Tris (见溶液配方)
40. 50× Denhardt’s Solution (100 ml) (见溶液配方)
41. 20× SSC (pH = 7.0) (见溶液配方)
42. 杂交液 (whole mount hybridization buffer) (见溶液配方)
43. RNase A储存液 (见溶液配方)
44. AP Buffer (Alkaline Phosphatase Buffer) (见溶液配方)
45. 封闭剂 (Blocking Reagent) (见溶液配方)
46. 羊血清封闭液 (见溶液配方)
47. Anti-Dig-AP抗体溶液 (见溶液配方)
48. NBT/BCIP显色剂 (见溶液配方)
49. 甘油溶液 (见溶液配方)

仪器设备

注：所有玻璃器皿和金属用具进行无RNA酶处理，具体操作：洗净烘干后用锡箔纸封口，180 °C烘烤4小时。所有不能烘烤的器皿用大量RNase free水冲洗，然后用擦镜纸沾取RNase AWAY (Invitrogen) 擦拭。实验台面用纸巾沾取无水乙醇擦拭。

1. 玻璃器皿
   量筒1,000 ml，100 ml，50 ml，25 ml，10 ml
   烧杯1,000 ml，400 ml，250 ml，200 ml，100 ml，50 ml
   细口瓶1,000 ml
   称量瓶20 ml
   玻璃棒
   蓝口瓶
2. 镊子：DUMONT #5一把；DUMONT #55一把
3. 样品勺：是取果蝇脑样本的关键，一般用直径0.5 mm铂金丝制作而成 (普通的不锈钢和铜丝易生锈影响实验，而且这些材料质地不够细密，易粘果蝇的组织)
4. MilliQ纯水仪 (Millipore)
5. 水浴锅 (电热恒温水箱) (北京市长风仪器仪表公司, model: HHW21)
6. DHG恒温鼓风干燥箱 (山东德瑞克仪器有限公司)
7. 微量恒温器 (北京市方通达科技有限公司, model: TDW-1)
8. 全自动数显立式高压蒸汽灭菌器 (青岛胜方分析仪器有限公司, model: YXQ-LS-50SII)
9. 电子秤 (Acculab, model: ALC-11002) 及微量电子称 (Sartorius, model: CP124S)
10. pH计 (Sartorius, model: PB-10)
11. 体式显微镜 (麦克奥迪, model: SMZ168，需要配20倍的目镜)
12. 冷光源 (北京福凯仪器有限公司, model: LGY-150)
13. 多道计时器
14. Leica DM 2500显微镜
15. 移液器
16. 冰箱 (4 °C和-20 °C)
17. 加热器
18. 电磁炉

实验步骤

实验步骤参考Inagaki等，(2005)；Li等，(2012和2014)；Tautz和Pfeifle，(1989)。

第一天
一、解剖和固定 (保持无RNA酶污染)
以做5孔成蝇脑原位杂交为例，第一天需要的溶液量：

1. 在预冷的1× PBS中解剖成蝇脑，用样品勺把解剖好的成蝇脑转移到固定液中。尽量解剖干净一些，去掉所有能看到的气囊丝。在培养板上选择5个孔，每个孔中加入0.6 ml 8%甲醛溶液，把培养板放在冰上。解剖一个固定一个，每个孔中放5个成蝇脑。
2. 成蝇脑在8%甲醛溶液中4 °C过夜固定。

二、杂交 (保持无RNA酶污染)
以做5孔成蝇脑原位杂交为例，第二天需要溶液量：

1. 用PTw室温洗涤3 × 10 min：在48孔板上依次加入600 μl PTw，用样品勺把样品从8%甲醛溶液中转移到PTw孔中，10分钟后转移到下一个孔中，共3次。
2. 把杂交液在85~90 °C中加热5~7分钟，然后放在冰上快速冷却至少5分钟。
3. 在48孔板上加入0.2 ml PTw，再加入0.2 ml杂交液，混匀后，用样品勺把样品从PTw中转移到混合液中。
4. 重新打开一个48孔板，在孔中加入0.3 ml杂交液，用样品勺把样品转移到杂交液中，用保鲜膜包裹住48孔板，放入60 °C水浴锅中，预杂交至少1个小时，最好4~5个小时。
5. 把探针液在85~90 °C中加热5~7分钟，然后放在冰上快速冷却至少5分钟。
6. 在48孔板中加入0.3 ml探针液，用样品勺把样品从杂交液中转移到探针液中，用保鲜膜包裹住48孔板，放入60 °C水浴锅中，过夜杂交。

三、洗涤和抗体孵育
以做5孔成蝇脑原位杂交为例，第三天需要的溶液量：

1. 在48孔板上加入0.3 ml回收杂交液，用样品勺把样品从探针液中转移到回收杂交液中。60 °C水浴锅中，10分钟。回收探针液。
2. 在48孔板上加入0.3 ml 4:1杂交液:PTw，用样品勺把样品从回收杂交液中转移到4:1杂交液:PTw中。60 °C水浴锅中，20分钟。
3. 在48孔板上加入0.3 ml 4:1杂交液:PTw，用样品勺把样品从回收杂交液中转移到4:1杂交液:PTw中。60 °C水浴锅中，20分钟。
4. 在48孔板上加入0.3 ml 3:2杂交液:PTw，用样品勺把样品从4:1杂交液:PTw中转移到3:2杂交液:PTw中。60 °C水浴锅中，20分钟。
5. 在48孔板上加入0.4 ml 2:3杂交液:PTw，用样品勺把样品从3:2杂交液:PTw中转移到2:3 杂交液:PTw中。60 °C水浴锅中，20分钟。
6. 在48孔板上加入0.4 ml 1:4杂交液:PTw，用样品勺把样品从2:3杂交液:PTw中转移到1:4杂交液:PTw中。60 °C水浴锅中，20分钟。
7. 用PTw在60 °C水浴锅中洗涤5 × 20 min：在48孔板上依次加入600 μl PTw，用样品勺把样品从1:4杂交液:PTw中转移到PTw孔中，20分钟后转移到下一个孔中，共5次。
8. 在48孔板上加入0.6 ml 2× SSC，用样品勺把样品从PTw中转移到2× SSC中。室温静置5分钟。
9. 在48孔板上加入0.4 ml 20 μg/ml RNase A溶液，用样品勺把样品从2x SSC中转移到20 μg/ml RNase A溶液中。在37 °C水浴锅中孵育30分钟。
10. 在48孔板上加入0.6 ml 2x SSC，用样品勺把样品从RNase A溶液中转移到2xSSC中。室温静置5分钟。
11. 用PTX在室温洗涤2 x 20 min：在48孔板上依次加入600 μl PTX，用样品勺把样品从2x SSC中转移到PTX孔中，20分钟后转移到下一个孔中，共2次。
12. 在48孔板上加入0.3 ml 0.5% block reagent溶液，用样品勺把样品从2x SSC中转移到0.5% block reagent溶液中。室温封闭至少1个小时。
13. 在48孔板上加入0.3 ml 0.5% block reagent和10%羊血清溶液，用样品勺把样品从0.5% block reagent溶液中转移到0.5% block reagent和10%羊血清溶液中。室温封闭至少1个小时。
14. 在48孔板上加入0.3 ml提前在胚胎中孵育后的抗体溶液，用样品勺把样品从0.5% block reagent和10%羊血清溶液中转移到抗体溶液中。4 °C过夜孵育。

四、洗涤和染色

1. 在48孔板上依次加入600 μl PTX，用样品勺把样品从抗体溶液中转移到PTX孔中，室温静置5分钟。回收抗体溶液，放在4 °C冰箱保存。
2. 用PTX在室温洗涤5 × 20 min：在48孔板上依次加入600 μl PTX，用样品勺把样品从PTX中转移到PTX孔中，20分钟后转移到下一个孔中，共5次。
3. 在48孔板上依次加入600 μl RNase free水，用样品勺把样品从PTX中转移到RNase free水孔中，室温静置3分钟。
4. 用AP buffer在室温洗涤2 × 5 min：在48孔板上依次加入600 μl AP buffer，用样品勺把样品从RNase free水中转移到AP buffer孔中，5分钟后转移到下一个孔中，共2次。
5. 在48孔板上依次加入400 μl染色剂，用样品勺把样品从AP buffer中转移到染色剂孔中，避光染色，注意观察信号强弱。
   注：此时需注意观察，如果染色剂变色 (浅紫)，可以换掉加入新鲜的染色剂。如希望染色慢些，可以放入4 °C。染色时间由于探针的不同而不同，有些探针10分钟就有信号，有些探针染色时间则长达3天。
6. 染色完成后，在48孔板上依次加入600 μl蒸馏水，用样品勺把样品从染色剂中转移到蒸馏水孔中，室温静置3分钟。
7. 用PTX在室温洗涤4 × 60 min：在48孔板上依次加入600 μl PTX，用样品勺把样品从蒸馏水中转移到PTX孔中，60分钟后转移到下一个孔中，共4次。
8. 在48孔板上依次加入400 μl 50% glycerol，用样品勺把样品从PTX中转移到50% glycerol孔中，几个小时后样品沉底。
   
9. 在48孔板上依次加入400 μl 70% glycerol，用样品勺把样品从50% glycerol中转移到70% glycerol孔中，此时样品既可以封片拍照也可以放入-20 °C保存。
   
10. 封片：将两片小圆片重叠后，贴在载玻片上，加入7 μl 70% glycerol，用样品勺依次把3~5个样品放入，用镊子夹着一根头发丝，在显微镜下把样品的位置摆正后，在小圆片周围涂上指甲油，不能太多和太少，和小圆片等高即可。用镊子将切好尺寸的盖玻片盖上。并在玻片上记下探针名称，果蝇品系，封片时间。

溶液配方

1. RNase free水
   使用高温烘烤后的细口瓶，接取纯水仪处理后的超纯水，用铝箔纸将瓶口裹紧，在15lbf/in2 (1,034 × 105 Pa) 高压下蒸气灭菌21 min，冷却至室温后使用
2. 10× PBS (pH = 7.4)
   
   以配制1,000 ml 10× PBS为例：
   
   1)

   称量80.06 g NaCl；2.01 g KCl；35.81 g Na₂HPO₄•12H₂O; 2.72 g KH₂PO₄加入1,000 ml烧杯中
   2)

   加入800 ml RNase free水，把烧杯放在设定为60 °C的水浴锅中，同时用玻璃棒搅拌使颗粒溶解
   3)

   用10 M NaOH溶液调pH值至7.4 (大约1,200 µl)
   4)

   用1,000 ml量筒定容后，倒入蓝口瓶中，在15lbf/in2 (1,034 × 105 Pa) 高压下蒸气灭菌21 min。保存于室温
   用RNase free水稀释10× PBS配制成1× PBS
   
3. PTw
   1× PBS + 0.1% Tween-20 (使用当天配)
   以配制1,000 ml PTw为例：
   用1,000 ml量筒量取1,000 ml 1× PBS
   加入1 ml Tween-20，充分混匀
4. PTX
   1× PBS + 0.3% Triton X-100 (使用当天配)
   以配制1,000ml PTX为例：
   用1,000 ml量筒量取1,000 ml 1× PBS
   加入3 ml Triton X-100，充分混匀
5. 0.5 M EDTA
   以配制100 ml 0.5 M EDTA溶液为例：
   
   1)

   称量14.6 g EDTA加入到250 ml烧杯中
   2)

   加入80 ml RNase free水，把pH计电极浸入溶液中，缓慢加入NaOH颗粒，同时用玻璃棒搅动
   3)

   等溶液澄清后用10 M NaOH溶液调pH值为8.0
   4)

   用100 ml量筒定容为100 ml，倒入蓝口瓶中，在15lbf/in2 (1,034 × 105 Pa) 高压下蒸气灭菌21 min，保存于室温
6. 1 M Tris
   1 M Tris溶液分为三种，分别为pH = 7.5、pH = 7.8、pH = 9.5
   以配制100 ml pH = 9.5 1 M Tris溶液为例：
   
   1)

   称量12.11 g Tris加入到250 ml烧杯中
   2)

   加入80 ml RNase free水，用玻璃棒搅拌使颗粒溶解
   3)

   用浓盐酸调pH值为9.5
   4)

   用100 ml量筒定容为100 ml，倒入蓝口瓶中，在15lbf/in2 (1,034 × 105 Pa) 高压下蒸气灭菌21 min，保存于室温
7. 50x Denhardt’s Solution (100 ml)
   1 g Bovine serum albumin (BSA) 1% (w/v)
   1 g Ficoll^TM 1% (w/v)
   1 g PVP 1% (w/v)
   用RNase free水定容至100 ml，分装为1 ml/管，-20 °C保存
8. 20× SSC (pH = 7.0) (1 L)
   
   1)

   称量 175.3 g NaCl；88.2 g柠檬酸钠加入1,000 ml烧杯中
   2)

   加入800 ml RNase free水，把烧杯放在设定为60 °C的加热器上，同时用玻璃棒搅拌使颗粒溶解
   3)

   用浓HCl调pH值至7.0
   4)

   用1,000 ml量筒定容后，倒入蓝口瓶中，在15lbf/in2 (1,034 × 105 Pa) 高压下蒸气灭菌21 min。保存于室温
9. 杂交液 (whole mount hybridization buffer)
   提供两个配方供参考，在与RNA探针杂交实验中使用配方1，因为其中含有的封闭成分比较多，有利于降低杂交的背景。但在杂交后的洗涤中使用不含sperm DNA的配方2，因为洗涤的要求不高，使用成分少的杂交液可以降低实验成本。溶液配好后放在-20 °C保存
   杂交液配方1
   
   杂交液配方2
   
   
10. RNase A储存液
    一般配制成10 mg/ml的储液。以配制10 ml为例：
    
    1)

    称量100 mg RNase A加入到20 ml称量瓶中
    2)

    加入9 ml RNase free水、100 μl 1 M Tris (pH 7.5)、150 μl 1 M NaCl, 用1 ml枪头搅拌溶液，使之溶解
    3)

    用电磁炉煮沸一锅水，将称量瓶放入沸水中15分钟
    4)

    取出称量瓶，放在室温下自然冷却至室温
    5)

    用10 ml量筒定容至10 ml
    6)

    分装为22 μl/管，保存在-20 °C冰箱
    使用时吸取20 μl加入到中10 ml 2× SSC，混匀后即为20 μg/ml RNase A溶液
    
11. AP Buffer (Alkaline Phosphatase Buffer) (使用当天配)
    
    
12. 封闭剂 (Blocking Reagent)
    一般配成10%储存液。以配制50 ml储存液为例：
    
    1)

    称量5 g封闭剂放入100 ml烧杯中
    2)

    加入约40 ml 1× MAB，用玻璃棒搅拌均匀，并水浴锅中60~80 °C加热溶解
    3)

    用1× MAB在50 ml量筒定容至50 ml，倒入离心管中，在15lbf/in2 (1,034 × 105 Pa) 高压下蒸气灭菌21 min
    4)

    分装为1 ml/管，放于-20 °C保存
    20 ml成蝇脑用0.5% block reagent：
    19 ml 1× PTX
    1 ml 10% block reagent
13. 羊血清封闭液
    封闭用正常羊血清原液 (10 ml/瓶)
    灭活：
    
    1)

    把羊血清放入56 °C水浴锅中，加热30分钟
    2)

    取出放在冰上冷却，分装为1 ml/管
    3)

    放入-20 °C冰箱保存
    20 ml成蝇脑用0.5% block reagent和10%羊血清封闭液：
    17 ml 1× PTX
    1 ml 10% block reagent
    2 ml 羊血清
14. Anti-Dig-AP抗体溶液
    成蝇脑用抗体的准备
    
    1)

    首先把胚胎处理至胚胎原位杂交步骤中复水后的胚胎 (李美霞等，2019)
    2)

    用10%羊血清 (in PTX) 在4 °C预孵育胚胎1个小时
    3)

    按照1:2,000的比例加入抗体Anti-Dig-AP在4 °C孵育12个小时
15. NBT/BCIP显色剂
    
    1)

    每毫升AP Buffer中加入4.5 μl NBT保存液和3.5 μl BCIP保存液
    2)

    在0.7 ml DMF (dimethylformamide，二甲基甲酰胺) 中加入0.3 ml RNase free水，混合均匀后为70% DMF
    3)

    NBT保存液：75 mg NBT (硝基四氮唑蓝) 溶解于1 ml 70%的DMF，分装为200 μl/管，-20 °C避光保存，保存期为1年
    4)

    BCIP保存液：50 mg BCIP (5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸) 溶解于1 ml 100%的DMF，分装为200 μl/管，-20 °C避光保存，保存期为1年
16. 甘油溶液
    
    1)

    50%甘油
    用25 ml量筒称量25 ml 1× PBS，倒入50 ml离心管中，然后直接向离心管中倒入甘油至管壁上50 ml刻度线处。充分混合均匀放在4 °C冰箱
    2)

    70%甘油
    用25 ml量筒称量15 ml 1× PBS，倒入50 ml离心管中，然后直接向离心管中倒入甘油至管壁上50 ml刻度线处。充分混合均匀放在4 °C冰箱

致谢

该文章得到国家自然科学基金 (31571033，91632107) 和中国科学院前沿重点研究计划 (QYZDY-SSW-SMC015) 的资助；该实验方案改编自中国科学院生物物理研究所温省云博士毕业论文 (2012)；使用该实验方案发表的文章：Li等 (2012和2014)。

参考文献

1. 李美霞，温省云，许孟博，崔名扬，刘力. (2019). 果蝇胚胎原位杂交实验方案. Bio-101 e1010246. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010246.
2. Inagaki, S., Numata, K., Kondo, T., Tomita, M., Yasuda, K., Kanai, A. and Kageyama, Y. (2005). Identification and expression analysis of putative mRNA-like non-coding RNA in Drosophila. Genes Cells 10(12): 1163-1173.
3. Li, M., Wen, S., Guo, X., Bai, B., Gong, Z., Liu, X., Wang, Y., Zhou, Y., Chen, X., Liu, L. and Chen, R. (2012). The novel long non-coding RNA CRG regulates Drosophila locomotor behavior. Nucleic Acids Res 40(22): 11714-11727.
4. Li, M., Xu, M., Wen, S., Bai, B., Chen, R. and Liu, L. (2014). One novel long noncoding RNA lnc10 in Drosophila. J Genet Genomics 41(2): 79-82.
5. Tautz, D. and Pfeifle, C. (1989). A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma 98(2): 81-85.