果蝇幼虫CNS原位杂交实验方案
In situ Hybridization in CNS of Drosophila Larvae   

材料与试剂

一、实验器具

1. 一次性耗材
   离心管50 ml, 10 ml, 1.5 ml
   一次性枪头1,000 μl, 200 μl, 100 μl, 10 μl
   封口膜或保鲜膜
   小圆片 (Zweckform Verstaerkungsringe, catalog number: 3510)
   指甲油
   铝箔纸
2. 孵育器皿
   1.5 ml离心管 (Axygen, catalog number: MCT-150-C)
3. 解剖器具
   
   1)

   解剖用塑料培养皿 (直径55 mm)：其底部要铺一层胶 (Dow Corning, Sylgard^® 184)，这样可避免镊子尖碰到底部时被弄弯
   2)

   培烧皿 (直径约4 cm带有磨口的盖子)：内装少量脱脂棉，并倒入少许75%的酒精。在解剖时当镊子尖端附着组织时，可以轻轻把镊子在酒精棉上擦拭，把镊子尖端的组织去掉
4. 玻片：20 mm × 40 mm，厚度小于20 μm
   玻片首先用浓硫酸浸泡过夜，用大量去离子水清洗，再用RNase free水冲洗3遍，放在脱色架上，60 °C烘干，用锡箔纸包好，室温保存备用。使用时用玻璃刀从中间划分为两半，即20 mm × 20 mm的大小作为载玻片。同时用玻璃刀把20 mm × 40 mm的玻片平均分成3份，即20 mm × 13 mm大小的作为盖玻片
   

1. RNase AWAY (Invitrogen, catalog number: 7491543)
2. Glycerol
3. KCl
4. Na₂HPO₄•12H₂O
5. KH₂PO₄
6. NaOH
7. 多聚甲醛 (Paraformaldehyde) (北京益利精细化学品有限公司)
8. Tween-20 (Sigma, catalog number: P1379)
9. Triton X-100 (ICN Biomedicals, catalog number: 58404)
10. Bovine serum albumin (BSA) (华美Sino-American Biotec BP 0042)
11. Ficoll^TM (华美Sino-American Biotec BIO 322)
12. PVP (华美Sino-American Biotec BR 2205)
13. NaCl (北京精细化工有限公司)
14. 柠檬酸钠 (北京精细化工有限公司)
15. HCl
16. Formamide (Amresco, catalog number: 1167B35)
17. Torula RNA (Type IX) (Sigma, catalog number: R3629)
18. Heparin (Sigma, catalog number: H3125)
19. Sonicated salmon sperm DNA (Stratagene, catalog number: 201190)
20. CHAPS (Sigma, catalog number: C3023)
21. Levamisol, an inhibitor of endogenous phosphatase (Sigma, catalog number: L9756)
22. DMF (Dimethylformamide, 二甲基甲酰胺) (防化学院化工厂)
23. NBT (硝基四氮唑蓝) (Amresco, catalog number: E1181)
24. BCIP (5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸) (Amresco, catalog number: E1041)
25. EDTA (Amresco, catalog number: 0322, MW = 292.25)
26. Tris (Amresco, catalog number: 0497, MW = 121.14)
27. RNase A (BBI, catalog number: RB0473)
28. 封闭剂 (Blocking Reagent) (Roche, catalog number: 11096176001)
29. Anti-Dig-AP抗体 (Roche, catalog number: 11093274910)
30. 甘油 (汕头市西陇化工有限公司)
31. RNase free水 (见溶液配方)
32. 10× PBS (pH = 7.4) (见溶液配方)
33. 4%多聚甲醛 (见溶液配方)
34. PTw (见溶液配方)
35. PTX (见溶液配方)
36. 0.5 M EDTA (见溶液配方)
37. 1 M Tris (见溶液配方)
38. 50× Denhardt’s Solution (100 ml) (见溶液配方)
39. 20× SSC (pH = 7.0) (见溶液配方)
40. 杂交液 (whole mount hybridization buffer) (见溶液配方)
41. RNase A储存液 (BBI, catalog number: RB0473) (见溶液配方)
42. AP Buffer (Alkaline Phosphatase Buffer) (使用当天配) (见溶液配方)
43. 封闭剂 (Blocking Reagent) (见溶液配方)
44. 羊血清封闭液 (见溶液配方)
45. Anti-Dig-AP抗体溶液 (见溶液配方)
46. NBT/BCIP显色剂 (见溶液配方)
47. 甘油溶液 (见溶液配方)

仪器设备

注：所有玻璃器皿和金属用具进行无RNA酶处理。具体操作：洗净烘干后用锡箔纸封口，180 °C烘烤4小时。所有不能烘烤的器皿用大量RNase free水冲洗，然后用擦镜纸沾取RNase AWAY (Invitrogen) 擦拭。实验台面用纸巾沾取无水乙醇擦拭。

1. 玻璃器皿
   量筒1,000 ml，100 ml，50 ml，25 ml，10 ml
   烧杯1,000 ml，400 ml，250 ml，200 ml，100 ml，50 ml
   细口瓶1,000 ml
   称量 20 ml
   玻璃棒
   蓝口瓶
2. 镊子：DUMONT #5一把；DUMONT #55一把
3. 样品勺：是取果蝇脑样本的关键，一般用直径0.5 mm铂金丝制作而成 (普通的不锈钢和铜丝易生锈影响实验，而且这些材料质地不够细密，易粘果蝇的组织)
4. MilliQ纯水仪 (Millipore)
5. 水浴锅 (电热恒温水箱) (北京市长风仪器仪表公司, model: HHW21)
6. DHG恒温鼓风干燥箱 (山东德瑞克仪器有限公司)
7. 微量恒温器 (北京市方通达科技有限公司, model: TDW-1)
8. 全自动数显立式高压蒸汽灭菌器 (青岛胜方分析仪器有限公司, model: YXQ-LS-50SII) 
9. 电子秤 (Acculab, model: ALC-11002) 及微量电子称 (Sartorius, model: CP124S)
10. pH计 (Sartorius, model: PB-10)
11. 体式显微镜 (麦克奥迪, model: SMZ168，需要配20倍的目镜)
12. 冷光源 (北京福凯仪器有限公司, model: LGY-150)
13. 多道计时器
14. Leica DM 2500显微镜
15. 移液器
16. 冰箱 (4 °C和-20 °C)
17. 加热器
18. 电磁炉

实验步骤

实验步骤参考Inagaki等，(2005)；Li等，(2012和2014)；Tautz和Pfeifle，(1989)。

第一天
一、解剖和固定 (保持无RNA酶污染)
以做5管幼虫CNS原位杂交为例，第一天需要的溶液量：

1. 在预冷的1× PBS中解剖三龄幼虫CNS (如图1)，用样品勺把解好的CNS转移固定液中。不必解剖的很干净，但不要带表皮，可以带mouthhook和discs。解剖一个固定一个，每个离心管中加入1 ml 4%多聚甲醛，离心管放在冰上。每个离心管中可放10个幼虫CNS。
2. 三龄幼虫CNS在4%多聚甲醛中4 °C过夜固定。
   
   
   图1. 三龄幼虫CNS. Scale bar = 100微米。
   

二、杂交 (保持无RNA酶污染)
以做5管幼虫CNS原位杂交为例，第二天需要的溶液量：

1. 用1 ml移液器吸掉4%多聚甲醛，加入1 ml PTw，室温静置10分钟。
2. 用1 ml移液器吸掉PTw，加入1 ml PTw，室温静置10分钟。重复该步骤3次。
3. 把杂交液在85~90 °C中加热5~7分钟，然后放在冰上快速冷却至少5分钟。
4. 用1 ml移液器吸掉PTw，加入0.2 ml PTw，再加入0.2 ml杂交液，轻弹管壁，混合均匀后，室温静置10分钟。
5. 用1 ml移液器吸掉PTw/杂交液，加入0.3 ml杂交液，60 °C水浴锅中预杂交至少1小时，最好4~5个小时。
6. 把探针液放入85~90 °C加热7分钟，然后放在冰上快速冷却至少5分钟。
7. 用200 μl移液器吸掉杂交液，加入0.2~0.3 ml探针液，用封口膜或保鲜膜把口封好，放入60 °C水浴锅中杂交过夜。
   注：步骤6和8中的杂交液可以回收成为回收杂交液。

三、洗涤和抗体孵育
以做5管幼虫CNS原位杂交为例，第二天需要的溶液量：

1. 回收探针液后，加入0.3 ml回收杂交液，60 °C水浴锅中10分钟。
2. 用1 ml移液器吸掉杂交液，加入0.3 ml回收杂交液，60 °C水浴锅中，10分钟。
3. 用1 ml移液器吸掉杂交液，加入0.3 ml 4:1杂交液:PTw，60 °C水浴锅中，20分钟。
4. 用1 ml移液器吸掉4:1杂交液:PTw，加入0.3 ml 3:2 杂交液:PTw，60 °C水浴锅中，20分钟。
5. 用1 ml移液器吸掉3:2杂交液:PTw，加入0.4 ml 2:3 杂交液:PTw，60 °C水浴锅中，20分钟。
6. 用1 ml移液器吸掉2:3杂交液:PTw，加入0.6 ml 1:4杂交液:PTw，60 °C水浴锅中20分钟。
7. 用1 ml移液器吸掉1:4杂交液:PTw，加入1 ml PTw，60 °C水浴锅中，20分钟。
   

注：步骤2~7中的杂交液应予以丢弃，不再回收使用。

8. 用1 ml移液器吸掉PTw，加入1 ml PTw，60 °C水浴锅中，20分钟。重复该步骤5次。
9. 用1 ml移液器吸掉PTw，加入1 ml 2× SSC，室温静置5分钟。
10. 用1 ml移液器吸掉2× SSC，加入1 ml 20 μg/ml RNase A溶液，在37 °C水浴锅中孵育10分钟。
11. 用1 ml移液器吸掉RNase A溶液，加入1 ml 2× SSC，室温静置5分钟。
12. 用1 ml移液器吸掉2× SSC，加入1 ml PTX，室温静置20分钟。
13. 用1 ml移液器吸掉PTX，加入1 ml PTX，室温静置20分钟。
14. 用1 ml移液器吸掉PTX，加入0.4 ml 0.5% block reagent (in PTX) 室温封闭至少1个小时。
15. 用1 ml移液器吸掉0.5% block reagent，加入0.4 ml 0.5% block reagent和10%羊血清室温封闭至少1个小时。
16. 用200 μl移液器吸掉0.5% block reagent和10%羊血清，加入0.2 ml提前在胚胎中孵育后的抗体孵育，4 °C过夜。

四、洗涤和染色

1. 回收抗体，放在4 °C保存。加入1 ml PTX，室温静置5分钟。
2. 用1 ml移液器吸掉PTX，加入1 ml PTX，室温静置5分钟。
3. 用1 ml移液器吸掉PTX，加入1 ml PTX，室温静置30分钟。重复该步骤4次。
4. 用1 ml移液器吸掉PTX，加入1 ml RNase free水，室温静置3分钟。
5. 用1 ml移液器吸掉RNase free水，加入1 ml AP buffer，室温静置5分钟。
6. 用1 ml移液器吸掉AP buffer，加入1 mlAP buffer，室温静置5分钟。
7. 用1 ml移液器吸掉AP buffer，加入0.4 ml NBT/BCIP染色剂避光染色。
   此时需注意观察，如果染色剂变色 (浅紫)，可以换掉加入新鲜的染色剂。如希望染色慢些，可以放入4 °C。染色时间由于探针的不同而不同，有些探针10分钟就有信号，有些探针染色时间则长达3天。
8. 染色完成后，用200 μl移液器吸掉染色剂，加入1 ml去离子水洗1次，室温静置3分钟。
9. 用1 ml移液器吸掉去离子水，加入1 ml PTX，室温静置10分钟。
10. 用1 ml移液器吸掉PTX，加入1 ml PTX，室温静置1小时。重复该步骤3~5次。这个过程中可以继续解剖染色后的样品，去掉CNS上其他的附着物。
11. 用1 ml移液器吸掉PTX，加入0.4 ml 50% glycerol，几个小时后等样品沉底。
12. 用1 ml移液器吸掉50% glycerol，加入0.4 ml 70% glycerol，此时的样品可以封片拍照也可以放入-20 °C保存。
13. 封片：将两片小圆片 (Zweckform Verstaerkungsringe) 重叠后，贴在载玻片上，加入7 μl 70% glycerol，用样品勺依次把3~5个样品放入，用镊子夹着一根头发丝，在显微镜下把样品的位置摆正后，在小圆片周围涂上指甲油，不能太多和太少，和小圆片等高即可。用镊子将切好尺寸的盖玻片盖上。并在玻片上记下探针名称，果蝇品系，封片时间。

溶液配方

1. RNase free水
   使用高温烘烤后的细口瓶，接取纯水仪处理后的超纯水，用铝箔纸将瓶口裹紧，在15lbf/in2 (1,034 × 105 Pa) 高压下蒸气灭菌21 min，冷却至室温后使用
2. 10× PBS (pH = 7.4)
   
   
   1)

   称量80.0 6 g NaCl；2.01 g KCl；35.81 g Na₂HPO₄•12H₂O；2.72 g KH₂PO₄加入1,000 ml烧杯中
   
   2)

   加入800 ml RNase free水，把烧杯放在设定为60 °C的水浴锅中，同时用玻璃棒搅拌使颗粒溶解
   
   3)

   用10 M NaOH溶液调pH值至7.4 (经验值为1,200 µl)
   
   4)

   用1,000 ml量筒定容后，倒入蓝口瓶中，在15lbf/in2 (1,034 × 105 Pa) 高压下蒸气灭菌21 min。保存于室温 
   用RNase free水稀释10× PBS配制成1× PBS
   
3. 4%多聚甲醛
   
   1)

   打开恒温水浴箱电源，设置温度为60 °C
   
   2)

   称量2 g多聚甲醛 (Paraformaldehyde)，放入200 ml烧杯中
   
   3)

   加入45 ml RNase free水，15 µl 10 M NaOH溶液，用锡箔纸密封烧杯口
   
   4)

   把烧杯放在60 °C水浴锅中加热20分钟，中间轻轻摇动烧杯几次，等待溶液澄清后取出烧杯，放在冰上冷却
   
   5)

   加入5 ml 10× PBS，仍旧用锡箔纸密封，放在4 °C冰箱中，三天内均可使用 PTw
   
4. 1× PBS + 0.1% Tween-20 (使用当天配)
   以配制1,000 ml PTw为例：
   用1,000 ml量筒量取1,000 ml 1× PBS，加入1 ml Tween-20，充分混匀
5. PTX
   1× PBS + 0.3% Triton X-100 (使用当天配)
   以配制1,000 ml PTX为例：
   用1,000 ml量筒量取1,000 ml 1× PBS，加入3 ml Triton X-100，充分混匀
6. 0.5 M EDTA
   以配制100 ml 0.5 M EDTA溶液为例：
   
   1)

   称量14.6 g EDTA加入到250 ml烧杯中
   
   2)

   加入80 ml RNase free水，把pH计电极浸入溶液中，缓慢加入NaOH颗粒，同时用玻璃棒搅动
   
   3)

   等溶液澄清后用10 M NaOH溶液调pH值为8.0
   
   4)

   用100 ml量筒定容为100 ml，倒入蓝口瓶中，在15lbf/in2 (1,034 × 105 Pa) 高压下蒸气灭菌21 min，保存于室温 1 M Tris
   
7. 1 M Tris
   1 M Tris溶液分为三种，分别为pH = 7.5、pH = 7.8、pH = 9.5
   以配制100 ml 1 M Tris (pH = 9.5) 溶液为例：
   
   1)

   称量12.11 g Tris加入到250 ml烧杯中
   
   2)

   加入80 ml RNase free水，用玻璃棒搅拌使颗粒溶解
   
   3)

   用浓盐酸调pH值为9.5
   
   4)

   用100 ml量筒定容为100 ml，倒入蓝口瓶中，用铝箔纸将瓶口裹紧，在15lbf/in2 (1,034 × 105 Pa) 高压下蒸气灭菌21 min，保存于室温 50× Denhardt’s Solution (100 ml)
   
8. 50× Denhardt’s Solution (100 ml)
   1 g 1% (w/v) Bovine serum albumin (BSA)
   1 g 1% (w/v) Ficoll^TM
   1 g 1% (w/v) PVP
   用RNase free水定容至100 ml，分装为1 ml/管，-20 °C保存
9. 20× SSC (pH = 7.0) (1 L)
   
   1)

   称量175.3 g NaCl；88.2 g柠檬酸钠加入1,000 ml烧杯中
   
   2)

   加入800 ml RNase free水，把烧杯放在设定为60 °C的加热器上，同时用玻璃棒搅拌使颗粒溶解
   
   3)

   用浓HCl调pH值至7.0
   
   4)

   用1,000 ml量筒定容后，倒入蓝口瓶中，在15lbf/in2 (1,034 × 105 Pa) 高压下蒸气灭菌21 min。保存于室温 杂交液 (whole mount hybridization buffer)
   
10. 提供两个配方供参考，在与RNA探针杂交实验中使用配方1，因为其中含有的封闭成分比较多，有利于降低杂交的背景。但在杂交后的洗涤中使用不含sperm DNA的配方2，因为洗涤的要求不高，使用成分少的杂交液可以降低实验成本。溶液配好后放在-20 °C保存
    杂交液配方1
    
    杂交液配方2
    
    
11. RNase A储存液
    一般配制成10 mg/ml的储液。以配制10 ml为例：
    
    1)

    称量100 mg RNase A加入到20ml称量瓶中
    
    2)

    加入9 ml RNase free水，100 μl 1 M Tris (pH = 7.5)，150 μl 1 M NaCl，用1 ml枪头搅拌溶液，使之溶解
    
    3)

    用电磁炉煮沸一锅水，将称量瓶放入沸水中15分钟
    
    4)

    取出称量瓶，放在室温中自然冷却至室温
    
    5)

    用10 ml量筒定容至10 ml
    
    6)

    分装为22 μl/管，保存在-20 °C冰箱
    使用时吸取20 μl加入到中10 ml 2× SSC，混匀后就是20 μg/ml RNase A溶液
12. AP Buffer (Alkaline Phosphatase Buffer) (使用当天配)
    
    
13. 封闭剂 (Blocking Reagent)
    一般配成10%储存液。以配制50 ml储存液为例：
    
    1)

    称量5 g封闭剂放入100 ml烧杯中
    
    2)

    加入约40 ml 1× MAB，用玻璃棒搅拌均匀，并水浴锅中60~80 °C加热溶解
    
    3)

    用1× MAB在50 ml量筒定容至50 ml，倒入离心管中，在15lbf/in2 (1,034 × 105 Pa) 高压下蒸气灭菌21 min
    
    4)

    分装为1 ml/管，放于-20 °C保存
    20 ml幼虫CNS用0.5% block reagent：
    19 ml 1x PTX
    1 ml 10% block reagent
14. 羊血清封闭液
    封闭用正常羊血清原液
    灭活：
    
    1)

    把羊血清放入56 °C水浴锅中，加热30分钟
    
    2)

    取出放在冰上冷却，分装为1 ml/管
    
    3)

    放入-20 °C冰箱保存
    20 ml幼虫CNS用0.5% block reagent和10%羊血清封闭液：
    17 ml 1× PTX
    1 ml 10% block reagent
    2 ml羊血清
15. Anti-Dig-AP抗体
    幼虫CNS用抗体的准备
    
    1)

    首先把胚胎处理至胚胎原位杂交步骤中复水后的胚胎 (李美霞等，2019)
    
    2)

    用10%羊血清 (in PTX) 在4 °C预孵育胚胎1个小时
    
    3)

    按照1:2,000的比例加入抗体Anti-Dig-AP在4 °C孵育12个小时
16. NBT/BCIP显色剂
    
    1)

    每毫升AP Buffer中加入4.5 μl NBT保存液和3.5 μl BCIP保存液
    
    2)

    在0.7 ml DMF (Dimethylformamide) 中加入0.3 ml RNase free水，混合均匀后为70% DMF
    
    3)

    NBT保存液
    75 mg NBT (硝基四氮唑蓝) 溶解于1 ml 70%的DMF，分装为200 μl/管，-20 °C避光保存，保存期为1年
    
    4)

    BCIP保存液
    50 mg BCIP (5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸) 溶解于1 ml 100%的DMF，分装为200 μl/管，-20 °C避光保存，保存期为1年
17. 甘油
    
    1)

    50%甘油用25 ml量筒称量25 ml 1× PBS，倒入50 ml离心管中，然后直接向离心管中倒入甘油至管壁上50 ml刻度线处。充分混合均匀放在4 °C冰箱
    
    2)

    70%甘油用25 ml量筒称量15 ml 1× PBS，倒入50 ml离心管中，然后直接向离心管中倒入甘油至管壁上50 ml刻度线处。充分混合均匀放在4 °C冰箱

致谢

该文章得到国家自然科学基金 (31571033，91632107) 和中国科学院前沿重点研究计划 (QYZDY-SSW-SMC015) 的资助；该实验方案改编自中国科学院生物物理研究所温省云博士毕业论文 (2012)；使用该实验方案发表的文章：Li等 (2012和2014)。

参考文献

1. 李美霞，温省云，许孟博，崔名扬，刘力. (2019). 果蝇胚胎原位杂交实验方案. Bio-101 e1010246. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010246.
2. Inagaki, S., Numata, K., Kondo, T., Tomita, M., Yasuda, K., Kanai, A. and Kageyama, Y. (2005). Identification and expression analysis of putative mRNA-like non-coding RNA in Drosophila. Genes Cells 10(12): 1163-1173.
3. Li, M., Wen, S., Guo, X., Bai, B., Gong, Z., Liu, X., Wang, Y., Zhou, Y., Chen, X., Liu, L. and Chen, R. (2012). The novel long non-coding RNA CRG regulates Drosophila locomotor behavior. Nucleic Acids Res 40(22): 11714-11727.
4. Li, M., Xu, M., Wen, S., Bai, B., Chen, R. and Liu, L. (2014). One novel long noncoding RNA lnc10 in Drosophila. J Genet Genomics 41(2): 79-82.
5. Tautz, D. and Pfeifle, C. (1989). A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma 98(2): 81-85.