柑橘果实初生代谢物测定
Determination of Primary Metabolites in Citrus Fruits   

材料与试剂

1. 1.5 ml离心管
   
2. 10 ml离心管
   
3. 1 ml注射器
   
4. 0.22 µm微孔滤膜
   
5. 气相质谱上样瓶
   
6. 柑橘果实组织样品
   
7. 液氮
   
8. 甲醇
   
9. 核糖醇
   
10. 盐酸甲氧胺
    
11. 吡啶
    
12. BSTFA: (三甲基硅烷基)三氟乙酰胺N,O-bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide 
    
13. TMCS: Trimethylchlorosilane
    
14. 核糖醇内标 (见溶液配方)
15. 盐酸甲氧胺(见溶液配方)
    

仪器设备

1. 研钵
   
2. -80 °C冰箱
   
3. -20 °C冰箱
   
4. 超声清洗仪
   
5. 水浴锅
   
6. 低温离心机
   
7. 真空浓缩仪
   
8. 真空干燥箱
   
9. 气相色谱-质谱联用仪 (Thermo, model: DSQⅡ)
   

实验步骤

1. 在研钵中充分研磨保存在-80 °C冰箱保存的柑橘果实样品，取150 mg充分研磨的样品加入盛有2,700 μl -20 °C预冷的甲醇的10 ml离心管中，摇匀后加入300 μl的核糖醇 (0.2 mg/ml) 内标，充分震荡至匀浆。
   
2. 将样品置于超声清洗仪中4°C超声处理15 min，70°C水浴孵育15 min，置于-20°C冰箱使溶剂冷凝。
   
3. 4°C，5,000 x g离心15 min；吸取100 µl上清于1.5 ml离心管中 (可以备份一份)，30 °C真空浓缩至干后置于-80 °C超低温冰箱备用。
   
4. 样品衍生化：在浓缩干的样品中加入50 μl的盐酸甲氧胺 (浓度为2 mg/ml，溶解于吡啶)，50 °C于真空干燥箱孵育30 min，然后再加入50 μl BSTFA+1% TMCS于真空干燥箱中，60 °C孵育40 min。过0.22 µm微孔滤膜后，置于气相质谱上样瓶中以待上样。
   
5. 气相色谱-质谱联用GC/MS (Thermo, DSQⅡ) 仪器运行条件：采用DB-5MS毛细管柱 (5%苯基/甲基聚硅氧烷，30 m x 0.25 mm x 0.25 μm)，离子源 (70 eV)，扫描范围为45-600 m/z，进样口温度为230 °C，传输线温度为250 °C，载气为高纯氦气 (99.999%)，载气流量为1.0 ml/min；程序升温以100 °C开始，保持1 min，以3 °C/min升至184 °C，0.5°C /min升至190 °C保持1 min，15 °C/min升至280 °C保持5 min；分流比为10:1；手动上样，进样量为1 μl。
   

注意事项

1. 组织样品一定要研磨充分。
   
2. 上样前一定要过0.22 µm微孔滤膜，以防堵塞毛细管柱。
   

溶液配方

1. 核糖醇内标：浓度为0.2 mg/ml，溶剂为蒸馏水
   
2. 盐酸甲氧胺：浓度为2 mg/ml，溶剂为吡啶