PEG法介导的柑橘原生质体转化
PEG-mediated Citrus Protoplast Transformation   

材料与试剂

注：本实验中叶片及愈伤的准备，原生质体的分离、纯化、活体检查操作步骤所需试剂见柑橘原生质体融合-电融合 (刘丹等，2018)。

1. 枪头
   
2. 灭过菌的瓶子
   
3. 离心管
   
4. 吸水纸
   
5. 真空管
   
6. 真空源
   
7. 1.5 ml微量离心管
   
8. 圆底螺旋盖离心管
   
9. 培养皿
   
10. 抗生素
    
11. LB
    
12. RNase A溶液
    
13. Buffer P1
    
14. RNA酶A
    
15. 缓冲液P2
    
16. 缓冲液BB
    
17. LyseBlue
    
18. BH₃营养液
    
19. 葡萄糖
    
20. 二甲基亚砜 (DMSO)
    
21. NaOH
    
22. PEG8000 MW (储备液，50%) (见溶液配方)
    
23. 40% (w/v) 聚乙二醇 (PEG) 工作溶液 (见溶液配方)
    
24. 洗脱溶液 (见溶液配方)
    

仪器设备

注：本实验中叶片及愈伤的准备，原生质体的分离、纯化、活体检查操作步骤所需设备见柑橘原生质体融合-电融合 (刘丹等，2018)。

1. 移液枪
   
2. 摇床
   
3. 离心机
   
4. CompactPrep Midi色谱柱
   
5. 倒置荧光显微镜
   

实验步骤

1. 材料的准备：愈伤以及叶片的准备 (详见柑橘原生质体融合-电融合 [刘丹等，2018]) 
   
2. 质粒的提取 (依据QIAGEN Plasmid Plus Purification Handbook — April 2012 - (EN) 改编) 
   2.1

   材料准备
   质粒、各种抗生素 (氨苄、卡那、壮观等)、加了抗生素的装有固体LB的皿、灭过菌的瓶子、枪头、50 ml离心管、10 ml离心管、5 ml枪头、吸水纸、1 ml以及5 ml的枪。
   
   2.2

   实验前质粒提取试剂的准备

   1)

   使用前将提供的RNase A溶液加入Buffer P1。使用1瓶RNA酶A (在使用前暂时离心)，每瓶缓冲液P1终浓度为100 μg/ ml。
   

   2)

   使用前将乙醇 (96-100%) 加入缓冲液PE中 (见容量瓶标签)。
   

   3)

   检查缓冲液P2和缓冲液BB是否由于低的储存温度而沉淀，必要时通过温热至37 °C溶解。
   

   4)

   使用后应立即关闭含有缓冲液P2的瓶子，以避免空气中的二氧化碳对缓冲液P2的酸化。
   

   5)

   可选：将提供的LyseBlue试剂加入缓冲液P1并在使用前混合。使用1瓶LyseBlue试剂/瓶缓冲液P1进行1:1,000的最终稀释 (例如10 μl LyseBlue到10 ml缓冲液P1中)。LyseBlue提供最佳缓冲液混合的视觉识别，从而防止导致低效细胞裂解和SDS，基因组DNA和细胞碎片不完全沉淀的常见操作错误。 
   2.3

   实验操作步骤

   1)

   从新鲜的有选择性的平板上挑选单个菌落，接种含有适当的选择性抗生素的500 μl液体LB培养基进行发酵剂。在37 °C温育剧烈摇动 (约300 rpm) 大约8小时。
   

   2)

   吸取25 μl的菌液到加了相应抗生素的50 ml液体LB培养基中，在37 °C恒温剧烈振荡 (约300 rpm) 摇12-16小时。
   

   3)

   在4 °C以6,000 x g离心15 min来收获细菌细胞。
   

   4)

   用2 ml Buffer P1重悬细菌沉淀。确保已将RNase A添加到Buffer P1中。 细应该通过涡旋或移液完全重新悬浮，直到没有细胞团块保留。
   

   5)

   加入2 ml Buffer P2，剧烈翻转密封管4-6次彻底混匀获得均匀着色的悬浮 液，室温 (15-25 °C) 孵育3 min。使用后应该立即关闭含有Buffer P2的瓶 子，以避免空气中的二氧化碳酸化。如果已将LyseBlue添加到Buffer P1 中，则在添加Buffer P2之后，细胞悬浮液将变成蓝色。
   

   6)

   加入2 ml Buffer S3，剧烈颠倒混匀4-6次。
   

   7)

   在4 °C下于12,000 x g离心30 min。离心后，上清液应澄清。
   

   8)

   若上清液不澄清，在4 °C下再次以12,000 x g离心15 min。转移上清液至 新的离心管中。
   

   9)

   在离心过程中，准备真空管和CompactPrep Midi色谱柱。
   

   10)

   向上清液中加入2 ml Buffer BB。通过颠倒4-6次混合并将调整后的溶解产 物混合液转移到连接在CompactPrep柱上的扩增管中。
   

   11)

   打开真空源，通过CompactPrep柱吸取溶液，然后关闭真空源。
   

   12)

   使用微型离心机清洗DNA，继续进行步骤a。或者，使用真空歧管洗涤DNA进行步骤b。

   1. 使用微量离心机清洗DNA：弃去扩增管，将CompactPrep柱放入2 ml收集管中。清洗CompactPrep柱，加入0.7 ml Buffer PE，离心1 min。丢弃2 ml收集管。
      
   2. 使用真空歧管清洗DNA：丢弃扩增管。加0.7 ml Buffer PE到柱子 上，打开真空管。要彻底清除残留的清洗Buffer，在溶液通过后再继续抽真空10 min。
      

   13)

   将CompactPrep柱放入干净的1.5 ml微量离心管中。加入100 μl或200 μl 缓冲液EB (10 mM Tris·Cl，pH 8.5) 或ddH₂O，放置1 min，然后离心1 min。
   

   14)

   检测其浓度，记录，并加入70%乙醇。
3. 原生质体的分离、纯化及活性检查 (详见柑橘原生质体融合-电融合 [刘丹等，2018]) 
   
4. 原生质体转化：聚乙二醇 (PEG) 诱导法
   4.1

   将原生质体重悬于BH₃营养液中，将其密度调为2 x 10⁶原生质体/ ml，在10 ml 圆底螺旋盖离心管中添加0.5 ml原生质体悬浮液。
   
   4.2

   加入30-40 μg质粒DNA (DNA应无菌，不要将DNA与原生质体过长孵育，因为 它可能由于核酸酶消化而导致较低的转化效率)，轻轻搅拌轻轻混匀。
   
   4.3

   立即将0.5 ml PEG溶液直接加入试管中心，以获得所需的最终PEG浓度 (20 %)，使PEG与原生质体混悬液轻轻搅拌混合。
   
   4.4

   静置30 min后，向每个转化试管中加入0.5 ml A + B溶液 (v:v = 9:1)，缓慢地 从试管内测边缘滴加，尽量不要搅动原生质体。
   
   4.5

   静置30 min让其孵育期，轻轻地将1 ml 0.6 M的BH₃营养液添加到试管的内边 缘，再次尝试不干扰原生质体。
   
   4.6

   再培养10 min后，用4个1 ml 0.6 M的BH₃营养液以5 min的间隔稀释原生质体 悬液到试管的内边缘，再次尝试不干扰原生质体。
   
   4.7

   用螺旋盖上密封试管，700 x g离心5 min。
   
   4.8

   小心吸出上清液，加入2 ml 0.6 M的BH₃营养液，轻轻悬浮原生质体。
   
   4.9

   700 x g离心5 min。
   
   4.10

   小心吸出上清液，加入2 ml 0.6 M的BH₃营养液，轻轻悬浮原生质体。
   
   4.11

   再次重复步骤4.9和4.10，小心避免原生质体的损失。
   
   4.12

   最后，将1-1.5 ml 0.6 M的BH₃营养液和0.6 M EME溶液以v:v = 1:1比例的混 合物加入到每个管中，轻轻地重悬原生质体。
   
   4.13

   将悬浮的原生质体转移到60 x 15 mm培养皿中，轻轻旋转培养皿，使其扩散 成薄层，用封口膜封好培养皿。
   
   4.14

   在28 ± 2 °C的避光培养箱中培养，24-48 h后在倒置荧光显微镜 (Olympus IX 71) 下观察并统计其瞬时转化效率，观察GFP表达情况。
   
   4.15

   将皿放回在28 ± 2 °C的避光培养箱中培养 (培养步骤详见柑橘原生质体融合-电融合 [刘丹等，2018])。

溶液配方

1. PEG8000 MW (储备液，50%) 
   1)

   将一瓶PEG置于80 °C的水浴中直至完全融化，取250 ml并与250 ml H₂O混合
   
   2)

   加入4 g树脂AG501-X8 (Bio-Rad) 中，搅拌30 min
   
   3)

   通过一层棉花过滤掉树脂并在使用前静置数小时，在4 °C储存
   
2. 40% (w/v) 聚乙二醇 (PEG) 工作溶液
   0.3 M葡萄糖，66 mM CaCl₂·2H₂O，pH 6.0
   制备100 ml 40% PEG溶液：
   1)

   将0.97 g CaCl₂·2H₂O和5.41 g葡萄糖溶解在10 ml H₂O中
   
   2)

   加入80 ml PEG储备溶液 (50%)，并且用H₂O (pH 6.0) 将体积调节至100 ml
   
   3)

   过滤灭菌并于4 °C储存。由于此溶液容易随时间而酸化，每2-3周检查一次pH值
   
3. 用于PEG去除的洗脱溶液
   溶液A：0.4 M葡萄糖，66 mM CaCl₂·2H₂O，10%二甲基亚砜 (DMSO)，pH 6.0
   溶液B：用NaOH固体调节0.3 M甘氨酸至pH 10.5，过滤灭菌
   在室温下储存并在使用前按照溶液A:溶液B = 9:1的比例混合以避免沉淀
   注：其他溶液以及配方详见柑橘原生质体分离、培养及融合再生。
   

参考文献

1. 刘丹，肖诗鑫，邓秀新，郭文武. (2018). 柑橘原生质体融合-电融合. Bio-101 e1010186. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010186.
2. Omar, A. A., Dutt, M., Gmitter, F. G. and Grosser, J. W. (2016). Somatic Embryogenesis: Still a Relevant Technique in Citrus Improvement. In: Germana, M. and Lambardi, M. (Eds.) In Vitro Embryogenesis in Higher Plants. Methods Mol Biol 1359: 289-327.