柑橘胚性愈伤组织诱导及愈伤悬浮系的建立
Culture of Callus Suspension from Citrus Ovule-derived Embryogenic Callus   

材料与试剂

1. 滤纸
   
2. 刀柄
   
3. 刀片
   
4. 长吸管
   
5. 玻璃器皿 (90 mm)
   
6. 双圈定性滤纸 (中速)
   
7. 柑橘败育胚珠
   
8. 75%酒精
   
9. Sucrose
   
10. Malt Extract
    
11. Glutamine
    
12. GA₃
    
13. 硫酸腺嘌呤
    
14. 培养基相关母液 (见溶液配方)
    1)

    GA₃储备液 (1 mg/ml)
    
    2)

    大量储备液 (100x)
    
    3)

    微量储备液 (100x)
    
    4)

    铁盐储备液 (100x) 
    
    5)

    肌醇储备液 (100x)
    
    6)

    甘氨酸储备液 (100x) 
    
    7)

    Vitamin B 储备液 (100x) 
    
    8)

    Vitamin C 储备液 (100x) 
15. 培养基的配制 (见溶液配方)
    1)

    MT基本培养基
    
    2)

    悬浮培养基
    
    3)

    MSG培养基

仪器设备

1. 镊子
   
2. 三角瓶
   
3. 酒精灯
   
4. 超净台
   
5. 摇床
   
6. 4 °C冷库
   

实验步骤

1. 胚性愈伤的诱导
   柑橘果实完全成熟时或近成熟时进行采摘，之后进行单果包装，贮存在4 °C冷库中备用。使用时将柑橘果实浸泡在75%酒精中20 min，切开，用尖嘴镊子将未发育胚珠挑出，置于MSG培养基暗培养，直至长出愈伤。在此培养期间，一个月继代一次。六个月后在培养基上培养的胚状体已有胚性愈伤组织形成,胚性愈伤组织呈白色颗粒状,且产生愈伤组织的部位多为胚状体的下胚轴。将白色颗粒状愈伤继代在MT固体培养基中光下培养继代保存。
   
2. 愈伤悬浮系的建立
   从固体培养基上挑选继代20天左右生长旺盛，疏松，颗粒细小的胚性愈伤组织于液体悬浮培养基 (100 ml三角瓶)，120 rpm/min振荡培养，每两周继代一次，继代3代后，若悬浮愈伤状态良好，可用于原生质体分离。
   

注意事项

1. 挑选柑橘果实时，应当挑选好果，表面没有损坏。
   
2. 建立愈伤悬浮系时，应当挑选生长旺盛，疏松，颗粒细小的愈伤组织。
   

溶液配方

1. 培养基相关母液
   1.1

   GA₃储备液 (1 mg/ml)
   GA₃ 100 mg加入1.0 ml 1 M KOH搅拌至GA₃完全溶解，然后加蒸馏水定容到100 ml，4 °C保存
   
   1.2

   以下溶液配方见柑橘组织培养常用培养基配制方法 (杨雯惠等，2018)

   1)

   大量储备液
   

   2)

   微量储备液 
   

   3)

   铁盐储备液
   

   4)

   肌醇储备液
   

   5)

   甘氨酸储备液
   

   6)

   维生素储备液
2. 培养基的配制
   2.1

   MT固体培养基、悬浮培养基详见柑橘组织培养常用培养基配制方法
   
   2.2

   MGS培养基

   肌醇储备液 (100x)	10 ml
   甘氨酸储备液 (100x)	10 ml
   微量储备液 (100x)	10 ml
   Fe2+-EDTA储备液 (100x)	10 ml
   Vitamin B储备液 (100x)	10 ml
   Vitamin C储备液 (100x)	10 ml
   大量储备液 (100x)	100 ml
   Sucrose	40 g
   Agar	8 g
   SAD	40 mg
   GA3 (1mg/ml)	1 ml

   加蒸馏水定容至1,000 ml，调pH至5.85，高压灭菌
   

参考文献

1. 霍合强, 郝玉金, 邓秀新. (1999). 宽皮柑橘品种的胚性愈伤组织诱导. 实验生物学报 9(3):32.
   
2. 吴金虎, 陈吉笙, 章文才, 万蜀渊. (1990). 柑橘胚珠培养及胚状体发生的研究. 果树科学 7(1):19-24.
   
3. 杨雯惠，解凯东，郭文武. (2018). 柑橘组织培养常用培养基配制方法. Bio-101 e1010184. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010184.