农杆菌介导水稻快速转化
Agrobacterium-mediated Rapid Transformation of Rice   

材料与试剂

1. 滤纸
   
2. 水稻种子
   
3. 75%酒精
   
4. 吐温20
   
5. 农杆菌菌株EHA105 (携带含目的基因载体)
   
6. 6-Benzylaminopurine (6-BA) (Sigma, catalog number: B-3408)
   
7. Kinetin (KT) (Sigma, catalog number: K-0753)
   
8. Naphthalene acetic acid (NAA) (Sigma, catalog number: N-0640)
   
9. Indole-3-acetic acid (IAA) (Sigma, catalog number: I-2886)
   
10. 2, 4-Dichlorophenoxyacetic acid (2, 4-D) (Sigma, catalog number: D-7299)
    
11. Kanamycin (USB, catalog number: 17924)
    
12. Casein Enzymatic Hydrolysate (CH) (Sigma, catalog number: N-4642)
    
13. Carbenicillin (Cn) (Bio Basic INC. catalog number: CDJ469)
    
14. Hygromycin B (Hn) (Roche, catalog number: 10843555001)
    
15. Nicotinic acid (Sigma, catalog number: N-0765)
    
16. Pyridoxine HCl (VB6) (Sigma, catalog number: P-8666)
    
17. Thiamine HCl (VB1) (Sigma, catalog number: T-3902)
    
18. Inositol (Sigma, catalog number: I-3011)
    
19. Phytagel (Sigma, catalog number: P-8169)
    
20. Dimethyl Sulfoxide (DMSO) (Sigma, catalog number: D-5879)
    
21. Acetosringone (AS) (Aldrich chem., CO 01531 EG)
    
22. Agar powder (日本分装，catalog number: BM0212)
    
23. Glycine (日本分装，catalog number: BA0802)
    
24. Proline (进口分装，catalog number: A1122)
    
25. D-sorbitol (上海生工，catalog number: SB0491)
    
26. NH₄NO₃
    
27. KH₂PO₄
    
28. KNO₃
    
29. MgSO₄·7H₂O
    
30. CaCl₂∙2H₂O
    
31. MnSO₄·4H₂O
    
32. ZnSO₄·7H₂O
    
33. H₃BO₃
    
34. KI
    
35. Na₂MoO₄·2H₂O
    
36. CoCl₂·6H₂O
    
37. CuSO₄·5H₂O
    
38. (NH₄)₂SO₄
    
39. FeSO₄∙7H₂O
    
40. Na₂EDTA∙2H₂O
    
41. KOH
    
42. HgCl₂
    
43. Glucose
    
44. Sucrose
    
45. LB培养基
    
46. 封口胶
    
47. MS_max储备液(10x) (见溶液配方)
    
48. MS_min储备液(100x) (见溶液配方)
    
49. N_6max储备液(10x) (见溶液配方)
    
50. N_6min储备液(100x) (见溶液配方)
    
51. Fe²⁺-EDTA储备液(100x) (见溶液配方)
    
52. Vitamin储备液(100x) (见溶液配方)
    
53. 6-BA储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)
    
54. KT储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)
    
55. 2, 4-D储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)
    
56. IAA储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)
    
57. NAA储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)
    
58. 200 mM AS储备液 (见溶液配方)
    
59. 1 N KOH储备液 (见溶液配方)
    
60. 0.15% HgCl₂ (见溶液配方)
    
61. 50% 葡萄糖 (见溶液配方)
    
62. 250 mg/ml Cn (见溶液配方)
    
63. 50 mg/ml Kan (见溶液配方)
    
64. 诱导培养基 (见溶液配方)
    
65. 悬浮培养基 (见溶液配方)
    
66. 共培养基 (见溶液配方)
    
67. 筛选培养基 (见溶液配方)
    
68. 分化培养基 (见溶液配方)
    
69. 生根培养基 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 超净台
   
2. 酒精灯
   
3. 镊子
   
4. 平皿
   
5. 三角瓶
   
6. 生根管
   
7. 摇床
   
8. 培养箱
   

实验步骤

1. 愈伤诱导
   选取成熟饱满的水稻种子，去壳；75%酒精消毒1~2 min，倒去酒精；用灭菌蒸馏水冲洗2次；加入0.15%的升汞(含有0.1%的吐温20)浸泡15~18 min，其间摇动数次；倒掉升汞，用灭菌蒸馏水冲洗5次。将消过毒的种子接入诱导愈伤培养基 (见溶液配方)，32 °C光照培养5~10 d (Toki, 1997; Toki等, 2006)。
   
2. 农杆菌划线活化
   在侵染的前2 d，取农杆菌在含50 mg/L kanamycin的LB培养基上划线，置于28 °C培养。
   
3. 农杆菌的悬浮、侵染及共培养
   侵染前，将活化的农杆菌刮入悬浮培养基 (见溶液配方) 中，28 °C，180 rpm震荡培养3~3.5 h，然后用悬浮培养基调节菌液浓度至OD₆₀₀=0.1~0.2。将诱导5~10 d愈伤组织放入农杆菌悬浮液中，侵染1.5 min。倒掉菌液，用灭菌滤纸吸干愈伤表面的菌液。愈伤表面覆盖灭菌滤纸，超净台吹干30 min。吹干后将愈伤转入表面覆盖有一层灭菌滤纸的共培养培养基 (见溶液配方)，先20 °C暗培养过夜，然后转入25 °C培养箱继续暗培养2 d。
   
4. 清菌
   共培养完成后，将愈伤组织用镊子转移到空的灭菌容器 (建议口比较大的玻璃瓶，便于操作) 中。用灭菌蒸馏水反复清洗愈伤7~8次，其中前面3次可快速清洗，后面3~4次清洗时每次浸泡3-5 min。最后用含有500 mg/L Cn的灭菌蒸馏水浸泡愈伤30 min。倒掉Cn溶液，用灭菌滤纸尽量吸干愈伤表面的水分，愈伤表面覆盖一层灭菌滤纸，超净台吹干1 h。
   
5. 筛选
   将经过清菌后的愈伤摆放到筛选培养基上 (见溶液配方)，32 °C，光照培养14 d。
   
6. 分化
   筛选14 d后，将抗性愈伤转入分化培养基 (见溶液配方)，28 °C培养 (光周期为14 h光照/10 h黑暗)。
   
7. 生根
   待抗性愈伤在分化培养基 (见溶液配方) 上形成3~4 cm高的再生苗时，将其转入生根培养基 (见溶液配方) 培养，至形成完整的植株。
   

实验结果

成熟水稻种子接种到诱导培养基5-10 d后，有明显的愈伤组织形成 (图1a、1b)；用农杆菌 (含有潮霉素抗性基因hpt和gfp表达框架) 对愈伤组织进行侵染，共培养3 d后，将愈伤组织接种到含有50 mg/L潮霉素的筛选培养基上，14 d后可以观察到新生愈伤组织，用荧光体视显微镜进一步观察，新生愈伤组织产生明显的绿色荧光信号，说明gfp基因整合到了水稻基因组 (图1c、1d)；将抗性愈伤组织接种到分化培养基，21 d左右有再生植株形成，用荧光体视显微镜进一步观察，转化再生植株有绿色荧光信号，说明gfp基因在转化再生植株中稳定表达(图1e、1f)。采用本实验中的快速转化方法，可以在50 d左右获得转化再生植株，相比先前的转化方法 (需要120 d左右) 遗传转化周期大大缩短。


图1. 农杆菌介导水稻快速转化。a和b分别为诱导5 d和10 d的水稻愈伤组织；c和d为筛选培养14 d形成的抗性愈伤组织；e和f为分化培养21 d形成的再生植株。

注意事项

1. 本实验方法已在日本晴、中花11、稻花香、Dongjin等粳稻品种上获得验证，通过调整培养基也可以用于籼稻材料的遗传转化。
   
2. 愈伤组织的诱导时间因材料的基因型、种子的质量等而呈现差异，因此诱导愈伤组织后需要经常观察其生长状态，以确定合适的诱导时间。
   
3. 由于愈伤诱导时间短，一些染有内生菌的愈伤在侵染时不易被识别，导致同一批次侵染的愈伤全部污染。因此首先要保证种子的质量，要求选用内生菌少且活力较高的种子。
   
4. 筛选过程也可以在封有透气封口膜的三角瓶中进行，以避免水汽凝结影响抗性愈伤组织生长。
   
5. 在清菌时，可以用镊子将愈伤组织与种子分开，以降低农杆菌污染的概率。
   
6. 抗性愈伤组织的筛选时间因材料而异，如果筛选时间超过14 d，则需要更换筛选培养基，以避免农杆菌污染。
   
7. 为避免分化过程中农杆菌污染，也可以在分化培养基中加入250 mg/L Cn。
   

溶液配方

一、培养基相关母液

1. MS_max储备液(10x)

   NH4NO3	16.5 g
   KH2PO4	1.7 g
   KNO3	19.0 g
   MgSO4·7H2O	3.7 g
   CaCl2∙2H2O	4.4 g

   逐个溶解，然后加蒸馏水定容至1 L。
   
2. MS_min储备液(100x)

   MnSO4·4H2O	2.23 g
   ZnSO4·7H2O	0.86 g
   H3BO3	0.62 g
   KI	0.083 g
   Na2MoO4·2H2O	0.025 g
   CoCl2·6H2O	0.0025 g
   CuSO4·5H2O	0.0025 g

   Na₂MoO₄·2H₂O单独溶解，再与其它组分混合，加蒸馏水定容到1 L，室温保存。
   
3. N_6max储备液(10x)

   KNO3	28.3 g
   KH2PO4	4.0 g
   (NH4)2SO4	4.63 g
   MgSO4∙7H2O	1.85 g
   CaCl2∙2H2O	1.66 g

   逐个溶解，然后加蒸馏水定容到1 L。
   
4. N_6min储备液(100x)

   MnSO4·4H2O	0.44 g
   ZnSO4·7H2O	0.15 g
   H3BO3	0.16 g
   KI	0.08 g

   逐个溶解，然后加蒸馏水定容到1 L。
   
5. Fe²⁺-EDTA储备液(100x)
   在一个试剂瓶中加入300 ml蒸馏水然后加入 FeSO₄∙7H₂O 2.78 g
   在另一试剂瓶中加入300 ml蒸馏水，并加热到70 °C，然后加入 Na₂ EDTA∙2H₂O 3.73 g
   都溶解好后，将两个试剂瓶中的溶液混合，在70 °C保温2 h，然后加蒸馏水定容至1 L，4 °C避光保存。
   
6. Vitamin储备液(100x)

   Nicotinic acid	0.1 g
   Pyridoxine HCl (VB6)	0.1 g
   Thiamine HCl (VB1)	0.1 g
   Glycine	0.2 g
   Inositol	10 g

   加蒸馏水定容到1 L，4°C保存。
   
7. 6-BA储备液(1 mg/ml)
   6-BA 100 mg
   加入1.0 ml 1N KOH搅拌至6-BA完全溶解，然后加蒸馏水定容到100 ml，4 °C保存。
   
8. KT储备液(1 mg/ml)
   KT 100 mg
   加入1.0 ml 1N KOH搅拌至KT完全溶解，然后加蒸馏水定容到100 ml，4 °C保存。
   
9. 2, 4-D储备液(1 mg/ml)
   2, 4-D 100 mg
   加入1.0 ml 1N KOH搅拌5 min，然后加10 ml蒸馏水搅拌至2,4-D完全溶解，用蒸馏水定容至100 ml，4 °C保存。
   
10. IAA储备液(1 mg/ml)
    IAA 100 mg
    加入1.0 ml 1N KOH搅拌至IAA完全溶解，然后用蒸馏水定容至100 ml，4 °C避光保存。
    
11. NAA储备液(1 mg/ml)
    NAA 100 mg
    加入1.0 ml 1N KOH搅拌至NAA完全溶解，然后用蒸馏水定容到100 ml，4 °C避光保存。
    
12. 200 mM AS储备液
    AS 0.39 g
    溶解于10 ml DMSO中，用1.5 ml离心管分装，-20 °C保存。
    
13. 1 N KOH储备液
    KOH 5.6 g
    用100 ml蒸馏水溶解，室温保存。
    
14. 0.15% HgCl₂
    HgCl₂ 1.5 g
    加蒸馏水溶解后定容至1,000 ml，加入1,000 μl 吐温20，混合均匀，放入棕色试剂瓶，室温保存。
    
15. 250 mg/ml Cn
    Cn 2.5 g
    超净台中加入灭菌蒸馏水至终体积为10 ml，完全溶解，-20 °C保存。
    
16. 50 mg/ml Kan
    Kan 0.5 g
    超净台中加入灭菌蒸馏水至终体积为10 ml，完全溶解，-20 °C保存。
    
17. 50% 葡萄糖
    葡萄糖 50 g
    加入蒸馏水溶解，定容至100 ml，121 °C灭菌15 min，4 °C保存。
    
    

二、培养基的配制

1. 诱导培养基

   N6max储备液(10x)	100 ml
   N6min储备液(100x)	10 ml
   Fe2+-EDTA储备液(100x)	10 ml
   Vitamin储备液(100x)	10 ml
   2, 4-D储备液	2.5 ml
   Proline	0.6 g
   CH	0.8 g
   Sucrose	30 g
   Phytagel	3 g

   先加入900 ml蒸馏水，用1 N KOH调至pH值为5.8，加蒸馏水定容至1 L，然后煮沸分装至100 ml三角瓶，高压灭菌。
   
2. 悬浮培养基
   

   N6max储备液(10x)	12.5 ml
   N6min储备液(100x)	1.25 ml
   Fe2+-EDTA储备液(100x)	2.5 ml
   Vitamin储备液(100x)	10 ml
   Proline	0.15 g
   CH	0.2 g
   2, 4-D储备液	0.625 ml
   Sucrose	9 g

   用1 N KOH调至pH值为5.2，加蒸馏水定容至250 ml，高压灭菌，使用时加入5 ml 50%葡萄糖与250 μl AS储备液。
   
3. 共培养基
   

   N6max储备液(10x)	12.5 ml
   N6min储备液(100x)	1.25 ml
   Fe2+-EDTA储备液(100x)	1.25 ml
   Vitamin储备液(100x)	2.5 ml
   2, 4-D储备液	0.625 ml
   Proline	0.15 g
   CH	0.2 g
   Sucrose	7.5 g
   Agar powder	2 g

   先加入200 ml蒸馏水，用1 N KOH调至pH值为5.6，加蒸馏水定容至250 ml，高压灭菌。使用之前加入5 ml 50%葡萄糖与250 μl AS储备液。
   
4. 筛选培养基
   

   N6max储备液(10x)	25 ml
   N6min储备液(100x)	2.5 ml
   Fe2+-EDTA储备液(100x)	2.5 ml
   Vitamin储备液(100x)	2.5 ml
   2, 4-D储备液	0.625 ml
   Proline	0.15 g
   CH	0.2 g
   Sucrose	7.5 g
   Agar powder	2 g

   先加入200 ml蒸馏水，用1 N KOH调至pH值为6.0，加蒸馏水定容至250 ml，高压灭菌。使用时加入250 μl Hn (50 mg/ml)和500 μl Cn (250 mg/ml)，倒入灭菌的平皿中，超净台上吹干约2 h使用。
   
5. 分化培养基
   

   MSmax储备液(10x)	100 ml
   MSmin储备液(100x)	10 ml
   Fe2+-EDTA储备液(100x)	10 ml
   Vitamin储备液(100x)	10 ml
   KT储备液	2.0 ml
   NAA储备液	0.2 ml
   Proline	0.6 g
   CH	0.8 g
   D-sorbitol	30 g
   Sucrose	30 g
   Phytagel	3.0 g

   先加入900 ml蒸馏水，用1 N KOH调至pH值为5.8，补蒸馏水定容至1 L，然后煮沸分装至100 ml三角瓶，高压灭菌。
   
6. 生根培养基

   MSmax储备液(10x)	50 ml
   MSmin储备液(100x)	5 ml
   Fe2+-EDTA储备液(100x)	5 ml
   Vitamin储备液(100x)	5 ml
   Sucrose	20 g
   Phytagel	3 g

   先加入900 ml蒸馏水，用1 N KOH调至pH值为5.8，加蒸馏水定容至1 L，然后煮沸分装至生根管，高压灭菌。
   

参考文献

1. Toki, S., Hara, N., Ono, K., Onodera, H., Tagiri, A., Oka, S. and Tanaka, H. (2006). Early infection of scutellum tissue with Agrobacterium allows high-speed transformation of rice. Plant J 47(6): 969-976.
   
2. Toki, S. (1997). Rapid and efficient Agrobacterium-mediated transformation in rice. Plant Mol Biol Rep 15: 16-21.