水稻类胡萝卜素含量的抽提与测定
Extraction and Determination of Carotenoid Content in Rice   

材料与试剂

1. 50 ml离心管，10 ml离心管
   
2. 各种型号的枪头
   
3. 1 ml注射器 (上海治宇医疗器械有限公司)
   
4. 0.22 μm滤膜 (津腾尼龙66)
   
5. 水稻组织样品
   
6. 液氮 (湖北省畜牧局制氧厂)
   
7. BHT (3,5-二叔丁基-4-羟基甲苯) (Sigma, USA, CAS: 128-37-0, HPLC)
   注：做为抗氧化剂保护类胡萝卜素成分也可作为内参做定 量分析，此试剂 也可用维生素E代替。
   
8. MTBE (甲基叔丁基醚) (Sigma, USA, CAS: 1634-04-4, HPLC)
   注：做为类胡萝卜素溶解液。
   
9. TEA (三乙胺) (国药试剂，分析纯)
   
10. 乙腈 (Fisher, USA, CAS: 75-05-8, HPLC)
    
11. 甲醇 (Fisher, USA, CAS: 67-56-1, HPLC)
    
12. 正己烷 (国药试剂，分析纯)
    
13. 丙酮 (国药试剂，分析纯)
    
14. 无水乙醇 (国药试剂，分析纯)
    
15. α-胡萝卜素 (Sigma St Louis, MO, USA)
    
16. β-胡萝卜素 (Sigma St Louis, MO, USA)
    
17. 叶黄素 (Sigma St Louis, MO, USA)
    
18. 紫黄质 (Sigma St Louis, MO, USA)
    
19. 抽提Buffer (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 超低温冰箱
   
2. 天平
   
3. 低温干燥仪 (Heto Lyolab 3000，Denmark)
   
4. 超声波仪 (昆山市超声波仪器有限公司)
   
5. 真空旋转仪 (Eppendorf concentrator 5301，USA)
   
6. 离心机 (Backman, USA)
   
7. 液相色谱仪 (Agilent 1100 series, USA)
   
8. 玻璃上样瓶及塑料内插管 (Agilent, USA)
   
9. 液相色谱柱：reverse-phase YMC 5-μm C30 column (250 x 4.6 mm)
   

实验步骤

1. 目的水稻组织取样后置于液氮中，带回实验室后可长期存于超低温冰箱或直接用于下面实验。
   
2. 液氮研磨水稻组织至粉末状后置于50 ml离心管，可存放或直接用于下面实验。
   
3. 置于低温干燥仪中低温(-20 °C至-50 °C)干燥约24 h至粉末干燥，确保粉末不是在冻融状态。
   
4. 每个编号的干燥粉末分成三份为三个技术重复，每份精确称取干样0.1 g置于10 ml离心管A中，每管加入4 ml抽提Buffer，超声波震荡抽提20 min，5,000 x g低温4 °C离心15 min，吸取上清至新10 ml离心管B中，再加入4 ml抽提Buffer至管A中，再次超声波震荡抽提20 min，5,000 x g低温4 °C离心15 min，吸取上清至新10 ml离心管B中合并。
   
5. 10 ml离心管B移至真空旋转干燥仪中，直至液体剩余0.5-1.5 ml时，将其转移至1.5 ml新离心管中。继续真空旋转干燥至干燥。
   
6. 向1.5 ml离心管B中加入150-200 μl MTBE溶解色素。12,000 x g低温4 °C离心30 min，将上清全部过滤(0.22 μm)入上样瓶中，液相色谱仪检测。
   
7. HPLC色谱条件：
   流动相A：乙腈：甲醇= 3:1 (含0.01% BHT，0.05% TEA)
   流动相B：MTBE (含0.01% BHT)
   流速：1 ml/min
   梯度洗脱：

   0 min	A-B (95:5)
   0-10 min	A-B (95:5)
   10-19 min	A-B (86:14)
   19-29 min	A-B (75:25)
   29-54 min	A-B (50-50)
   54-66 min	A-B (26-74)
   67 min	A-B (95:5)

结果与分析

根据内参的加入量及内参色谱结果的峰面积按比例计算出类胡萝卜素浓度，再根据算出的类胡萝卜素浓度值计算出水稻样品中的类胡萝卜素浓度 (图1)。


图1. 色谱结果示意图

注意事项

1. 色谱级α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、叶黄素、紫黄质等标准品购于Sigma (St Louis, MO, USA)。标准品的目的是标识出目的物质的出峰位置，同一台仪器相同的条件下标样调试一次即可，以后可根据出峰时间估计出目的物质，有时出峰时间会出现飘移但偏差不会太大，此时可采用手动积分计算峰面积。
   
2. 以上有机试剂均是易燃、易爆、对皮肤和黏膜有刺激性，应在通风橱操作，避免火源。
   

溶液配方

1. 抽提Buffer
   正己烷:丙酮:无水乙醇=2:1:1 (含质量0.01% BHT) (体积比)