凝胶阻滞(EMSA)
EMSA Protocol   

材料与试剂

1. 离心管
   
2. 滤纸
   
3. 保鲜膜
   
4. X光片
   
5. 大片段DNA聚合酶 (Large Fragment DNA Polymerase I) (Invitrogen, USA, catalog number: 18012-021)
   
6. dNTP* (专用), 由dATP, dTTP, dGTP (Takara, Japan, catalog numbers: D4026A, D4027A, D4029A) 1:1:1配制，即各取1 μl，再加入497 μl灭菌ddH₂O混匀
   
7. 10x M buffer (TaKaRa, catalog number: CA1401B) (Takara酶切试剂中附带的紫盖buffer)
   
8. 10x Loading Buffer (TakaRa, catalog number: CA2601A) (Takara酶切试剂中附带)
   
9. 30% Acrylamide
   
10. Tris base
    
11. HCl
    
12. SDS
    
13. AP (过硫酸胺)
    
14. TEMED
    
15. 甘油
    
16. α ³²P dCTP
    
17. MgCl₂
    
18. NaCl
    
19. EDTA
    
20. DTT
    
21. 甘氨酸 (Glycine)
    
22. BSA
    
23. 分离胶 (见溶液配方)
    
24. 10x binding Buffer (见溶液配方)
    
25. 电泳缓冲液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 蛋白质分离胶电泳仪 (同位素室配置)
   
2. 离心机
   
3. 盖革计数器
   
4. 同位素室
   
5. 暗室
   
6. 红光灯
   

实验步骤

1. 实验设计
2. 制分离胶 (溶液配方1)。注意凝胶内不能产生气泡以免影响样品电泳和放射自显影结果。该步骤可不在同位素室制备，电泳时利用同位素室配置的电泳仪进行操作。
   
3. 标记探针
   

   探针	4 μl
   dNTP*(专用)	2 μl
   10x M buffer	2 μl
   大片段DNA 聚合酶	1 μl
   ddH2O	9 μl
   α 32P dCTP	2 μl

   20 μl总体积
   室温放置40 min-1 h，在第4步使用时需另补充30 μl ddH₂O稀释标记好的探针以降低过于强烈的目标信号和背景噪音。在同位素室的有机玻璃防护设施内进行。
   
4. 蛋白与探针混合孵育
   细胞核提取物，3-20 μg，如是纯化蛋白，200-500 ng
   10x binding Buffer 2 μl
   补ddH₂O至16 μl
   轻弹混匀后低速离心1 min，将稀释后的探针(第3步) 4 μl加到1.5 ml离心管管底(同位素室操作)，用手指轻弹混匀。室温中放置，将探针与DNA混合孵育15-20 min。该步骤在同位素室的有机玻璃防护设施内进行。
   
5. 预电泳。在上样品之前，将制好的分离胶放入同位素室的电泳仪进行预电泳。
   
   1. 先加缓冲液，再取下分离胶上的梳子。
      
   2. 用1 ml移液枪或者胶头吸管吸取缓冲液对每个梳孔进行反复吸打，以清理干净残胶，避免对样品的迁移产生影响。
      
   3. 在每个梳孔上样约5 μl 的10x loading buffer。在80-90 V电泳约1个小时。因为溴酚蓝显示蓝色，可作为电泳迁移时的指示剂用于指示电泳进行的情况，比如胶的密度的一致性和导电性情况。如果蓝色条带粗，扩散和弯曲状，说明胶有问题，需要重新制胶。
      
6. 点样。使用同位素室的有机玻璃防护设施内的电泳仪进行电泳分离复合物和非结合的探针。
   
   1. 先用EMSA设施内的20 μl移液枪分装10x loading buffer 2-3 μl到每个样品的试管内壁上，作为指示剂。
      
   2. 再用同一移液枪吸取内壁指示剂和管底所有样品进行点样到制好的凝胶的梳孔内。电压设置为80-90 V，用新制备的电泳缓冲液进行电泳约1.5-2.0 h。当缓冲液中的蓝色染料溴酚蓝迁移至胶的下缘1/4处时，可停止电泳。
      
7. 压X光片
   电泳结束后，将含有凝胶的玻璃板从电泳仪上卸下。分开胶板后，用比玻璃板略大的一块滤纸对准EMSA凝胶，缓慢小心将EMSA胶从胶板上粘下，再用另一块同样大小的滤纸将凝胶的另一面盖住，轻轻把滤纸和胶压紧，然后用单层保鲜膜将含有胶的滤纸包好压在暗夹内。在暗室的有机玻璃防护设施后将X光片放置到暗夹内的凝胶上面。封好暗夹后暗室放置4-5 h。
   Tip：由于放射性同位素的衰变，如果使用为新订购回来的新同位素，压片时间可以缩短为一半时间：2-3 h。
   
8. 显影
   在暗室内，准备三个盆子，分别装显影液、水、定影液。取出X光片，在显影液浸泡几秒钟，待有清晰的游离探针出现时，迅速在水中清洗几秒钟，同时放在红灯上迅速观察滞后带的信号情况，放入定影液进行定影。
   Tip：根据阳性对照的信号情况，可以对显影时间进行稍微延长或缩短。这有利于控制和降低X光片的背景噪音信号。
   

注意事项

1. 预电泳时，电泳缓冲液内可以加入特定的小分子添加试剂。如果该添加剂对DNA的特异性或者蛋白-DNA的稳定性有帮助。
   
2. DNA和蛋白的互作稳定性受到孵育缓冲液里的盐浓度和pH的影响。因此可以尝试不同的缓冲液 (Hellman and Fried, 2007)。
   
3. 与DNA互作的粗体蛋白和纯化蛋白的浓度在随着实验进行，需要被优化。因为过多或者过少的蛋白浓度都会对信号结果的读取产生影响。
   
4. 一般情况下，在本实验的分离胶中和所设置的电压下，指示剂与最终显影结果中的游离探针的位置相近。由于最终X光片上需要保留游离探针信号作为观察对比DNA-蛋白的结合强度因此不能让指示剂跑出胶外。
   
5. 跑胶的两块小玻璃板被放射性同位素污染，必须在同位素室有机玻璃挡板后的水龙头上反复冲洗，用盖革计数器检测残留信号后，再带回实验室的特定抽屉放置，以备下次重复利用。
   

溶液配方

1. 分离胶配方 (6% SDS-PAGE) (8 ml)

   ddH2O	4.24 ml
   30% Acrylamide	1.60 ml
   1.5 M Tris-HCl (PH 8.8)	2.00 ml
   10% SDS	0.08 ml
   10% AP	0.08 ml
   TEMED	0.0064 ml

2. 10x binding Buffer

   80%甘油	62.5 μl
   0.1 M MgCl2	10.0 μl
   5 M NaCl	10.0 μl
   1 M Tris-HCl (pH = 8.0)	10.0 μl
   0.5 M EDTA	2.0 μl
   1 M DTT	1.0 μl
   ddH2O	4.5 μl
   至总体积	100.0 μl

3. 电泳缓冲液
   甘氨酸(Glycine) 18.8 g
   Tris粉3.02 g，加单蒸水定容至1 L
   BSA终浓度为0.1 mg ml⁻¹或更少
   

参考文献

1. Hellman, L. M. and Fried, M. G. (2007). Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc 2(8): 1849-1861.