蛋白质磷酸化活性分析
Protein Phosphorylation Activity Assay   

材料与试剂

1. 滤纸
   
2. 保鲜膜
   
3. 氯化镁 (Magnesium chloride, MgCl₂) (Sigma, USA, catalog number: 449172)
   
4. 氯化锰 (Manganese(II) chloride, MnCl₂) (Sigma, USA, catalog number: 450995)
   
5. 牛髓磷脂碱性蛋白 (Myelin Basic Protein bovine, MBP) (Sigma, USA, catalog number: M1891)
   
6. 三磷酸腺苷 (Adenosine tripHospHate, ATP) (Sigma, USA, catalog number: A2383)
   
7. β-巯基乙醇 (2-Mercaptoethanol) (Fluka, USA, catalog number: 63690)
   
8. Tris (ANGUS chemical company, USA, catalog number: 77-86-1)
   
9. 二硫苏糖醇 (Dithiothreitol, DTT) (上海生工，中国，catalog number: DB0058)
   
10. 考马斯亮蓝R-250(Coomassie Brilliant Blue) (上海生工，中国，catalog number: CB0037)
    
11. 十二烷基硫酸钠 (Sodium dodecyl sulfate, SDS) (上海生工，中国，catalog number: SB0485)
    
12. 溴酚蓝 (BromopHenol blue) (上海生工，中国，catalog number: B0449)
    
13. 甘氨酸 (Glycine) (上海生工，中国，catalog number: G0167)
    
14. 盐酸 (Hydrochloric acid, HCl) (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)
    
15. 甘油 (Glecerol) (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)
    
16. 异丙醇 (Isopropyl alcohol) (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)
    
17. 冰醋酸 (Acetic acid) (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)
    
18. 95%乙醇(Ethanol) (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)
    
19. Kinase Buffer (见溶液配方)
    
20. 5x SDS-PAGE Loading Buffer (见溶液配方)
    
21. 5x Tris-Glycine Buffer (见溶液配方)
    
22. 考马斯亮蓝R-250染色液 (见溶液配方)
    
23. 脱色液(见溶液配方)
    

仪器设备

1. Mini-PROTEAN^® Tetra System (Bio-Rad, USA)
   
2. 盖革计数器
   
3. 移液枪
   
4. 暗夹
   

实验步骤

1. 预先在冰上配制kinase buffer (溶液配方1)；
   
2. 加入1-5 μg待测蛋白和1-5 μg MBP (检测待测蛋白是否具有自磷酸化活性时，不添加MBP) 至上述缓冲液中，使终体积为20 μl；
   
3. 室温 (或置26 °C水浴中) 反应30 min；
   
4. 加入5 μl 5x SDS-PAGE loading buffer (溶液配方2)，75 °C加热5-10 min；
   
5. 冷却至室温；
   
6. 12% SDS-PAGE凝胶电泳分离，待染料线距离凝胶底部1-2 cm时停止电泳；
   
7. 用塑料铲板将浓缩胶及染料线之下的凝胶 (包含染料线) 切下丢弃，剩余凝胶置于蒸馏水中漂洗掉表面的SDS，然后将凝胶置于滤纸上吸干水分，用保鲜膜将凝胶包好；
   
8. 在暗室中进行下列操作：将已经用保鲜膜包好的凝胶置于暗夹中，用X-光片覆盖于凝胶上，扣好暗夹并将暗夹置于避光处 (如抽屉中) 3-5 h；
   
9. 在暗室中将X-光片显影并定影，之后用考马斯亮蓝R-250染色液对凝胶染色并用脱色液脱色；
   
10. 扫描或拍照X-光片及脱色后的凝胶，对结果进行分析。
    

注意事项

1. 对于某些对特殊离子具有依赖性的蛋白激酶 (如钙离子依赖性蛋白激酶)，应对kinase buffer中的成分进行调整。
   
2. 对于某些对温度敏感的蛋白激酶，应调整步骤3中的反应温度。
   
3. 步骤4中避免加热温度过高或时间过长，否则离心管盖容易冲开，造成管内液体飞溅，从而造成同位素污染事故。
   
4. 放射性同位素操作应在规范的专用操作室内进行；含放射性同位素的废弃物 (废纸、废液等) 应按规定进行规范处理。
   
5. 尽量避免待测蛋白在制备过程中活性受到损害。
   

溶液配方

1. Kinase Buffer
   50 mM Tris-HCl, pH 7.5
   10 mM MgCl₂
   10 mM MnCl₂
   1 mM DTT
   0.2 mM ATP
   5 μCi [γ-³²P]ATP
   该缓冲液于冰上配制，现配现用，不可长久保存。
   
2. 5x SDS-PAGE Loading Buffer
   250 mM Tris-HCl, pH 6.8
   10% (w/v) SDS
   0.5% (w/v) BromopHenol Blue
   50% (v/v) Glycerol
   用前加入5% (v/v) β-巯基乙醇或50 mM DTT，加入β-巯基乙醇或DTT的loading buffer可在室温下放置一个月。
   
3. 5x Tris-Glycine Buffer
   0.125 M Tris
   1.25 M Glysine
   0.5% (w/v) SDS
   
4. 考马斯亮蓝R-250染色液
   0.1% (w/v) 考马斯亮蓝R-250
   25% (v/v) 异丙醇
   10% (v/v) 冰醋酸
   
5. 脱色液
   10% (v/v) 冰醋酸
   5% (v/v) 乙醇