材料和试剂

厌氧菌培养实验
血清瓶 N20，120 mL（ MediPac ，目录号：10113100）或等效物
输液瓶，1 L（VWR，目录号：215-9243）或等效物
丁基橡胶塞 N20（ Glasgerätebau Ochs，目录号： 102049 ）或等效物
用于 1 L 输液瓶的橡胶塞 (ERIKS)
压接铝盖（WICOM，目录号：WIC 44580）或等效物
压接器（VWR，目录号：548-0073）
（VWR，目录号：548-0074）
螺丝顶，带孔 Ø 19 mm（VWR：目录号：MUEL14.076.04）
Duran烧瓶，1 L（VWR，目录号：SCOT818015403 ）
®橡胶塞烧瓶（ Glasgerätebau Ochs，目录号：444704）
演讲瓶控制阀（Sigma，目录号：Z146951）
无菌注射器，公Luer -Lock（Fisher Scientific，目录号：14955461）或等效物
Luer -to -tubing连接器，母Luer -Lock （Sigma，目录号：Z261580）
一次性使用的无菌 ERSTA 注射器，1 mL（Th. Geyer，目录号：6075936）或等效物
一次性针头（Carl Roth，目录号：X132.1）或等效物
无菌注射器过滤器，0.2 µm 孔径（VWR，目录号：514-0061）
Na 2 S·9H 2 O（Sigma，目录号：1313-84-4）；储存于 4°C
（Carl Roth，目录号： 9304.1 ）；在室温 (RT) 下储存
刃天青钠盐（Sigma，目录号：R7017）；存储在 RT
氢气（Air Liquide Deutschland，目录号：P0231L50R2A001）
二氧化碳气体（Air Liquide Deutschland，目录号： P0760L50R0A001)
二氧化碳 13 气体，99% 13 C（Sigma，目录号： 364592）
L-谷氨酸-1- 13 C ，99% 13 C （Sigma，目录号： 604968）
H. maritima培养基（从DSMZ 854 修改）（见配方 1）
D. acetivorans、D. multipotens和D. propionica培养基（由 DSMZ 480 修改）（参见配方 1）
SL-10 微量元素溶液（见配方 2）
沃尔夫维生素溶液（见配方 3）
微量元素溶液 (DSMZ 141)（见配方 4）

生物质的收获和细胞提取物的制备
折叠过滤器， Ø 240 mm（Whatman Schleicher & Schuell ，目录号：10311651）或同等产品
短杆漏斗（VWR，目录号：221-0180）或同等产品
带密封盖的离心瓶，1 L（Thermo Fisher Scientific，目录号：05-564-26）或同等产品
离心管，50 mL（VWR，目录号：21008-940）或同等产品
微量离心管，1.5 和 2 mL（VWR，目录号：72.690.001、72.689）或同等产品
血清移液管（Thermo Fischer Scientific，目录号：170350）或同等产品
液氮
0.9% [w/v] NaCl 溶液（盐水）
铝冷却块（Sigma，目录号：Z743486）
细胞裂解缓冲液（见配方 5）

酶测定
列出了反应混合物。工作时，我们建议将所有化学物质和帮助酶放在冰上。除非另有说明，否则所有列出的组分都用 dH 2 O 溶解或稀释。当因其稳定性而需要特别注意时，会报告推荐的储存条件或特殊说明（例如，在检测前刚溶解）。有机酸和ATP溶液的pH值应调至中性； Tris-HCl 缓冲液的 pH 值可以在 RT 进行调整，但请注意，当最终测试温度与 RT 不同时，pH 也会根据以下公式变化： ΔpKa /°C≈-0。 028（例如，温度每升高 1°C，Tris 溶液的 pH 值就会降低 0.028 个 pH 单位）。对于长期储存，有机化合物和 CoA 酯溶液应保持在 -20°C 或 -80°C，除非另有说明；所有缓冲液和盐溶液都可以保存在室温。根据先前描述的方法（Simon等人，1953），由相应的酸酐和 CoA 化学合成乙酰辅酶 A。
在我们的例子中，储备溶液的浓度如下：
柠檬酸合酶（正向反应，分光光度连续测定）
1 M Tris-HCl（pH 7.5）（Carl Roth，目录号：9090.4）
50 mM草酰乙酸，在-20°C或-80°C下储存≤2个月（Sigma，目录号：04126）
10 mM 乙酰辅酶A
10 mM 5,5-二硫代双-2-硝基苯甲酸（DTNB），新鲜溶于100 mM Tris-HCl（pH 7.5）（Sigma，目录号：D8130）
柠檬酸合酶（反向反应，分光光度连续测定）
1 M Tris-HCl（pH 7.8）（Carl Roth，目录号：9090.4）
50 毫米氯化镁2
50 mM二硫赤藓糖醇（DTE），新鲜溶解（Sigma，目录号：D8255）
5 mM CoA（ Neofroxx ，目录号：2100GR005）
200 mM柠檬酸盐（Sigma，目录号：C8532）
5 mM NADH，新鲜溶解（ Acros Organics ，目录号：10711911）
200 U / mL猪苹果酸脱氢酶，储存在4°C，新鲜稀释（ Sigma，目录号：M1567 ）
柠檬酸合酶（逆向反应，UHPLC 不连续测定）
1 M Tris-HCl（pH 7.8）（Carl Roth，目录号：9090.4）
50 毫米氯化镁2
50 mM DTE，新溶解（Sigma，目录号：D8255）
5 mM CoA （ Neofroxx ，目录号：2100GR005）
200 mM柠檬酸盐（Sigma，目录号：C8532）
5 mM NADH，新鲜溶解（ Acros Organics ，目录号：10711911）
200 U / mL猪苹果酸脱氢酶，储存在4°C，新鲜稀释（Sigma，目录号：M1567）
小瓶插入物，250 µL，拉尖玻璃（Agilent，目录号：5183-2085）
螺口样品瓶、2 mL 和螺帽（安捷伦）或同等产品
微孔板，无菌，96 孔（Greiner Bio-One，目录号：655161）或等效物
膜过滤器，0.22 µm 孔径（Sigma，目录号：GSWP04700）
无水乙腈，99.8%（Sigma，目录号：271004）
停止溶液（见配方 6）
UHPLC 级双蒸水（见配方 7）
磷酸钾缓冲液（见配方 7）
ATP-柠檬酸裂解酶
1 M Tris-HCl（pH 7.5）（Carl Roth，目录号：9090.4）
100 毫米氯化镁2
10 mM ATP，新鲜溶解（Sigma，目录号：A26209）
50 mM DTE，新溶解（Sigma，目录号：D8255）
50 mM CoA （ Neofroxx ，目录号：2100GR005）
100 mM柠檬酸盐（Sigma，目录号：C8532）
5 mM NADH，新鲜溶解（ Acros Organics，目录号：10711911）
200 UF / mL猪苹果酸脱氢酶，储存在4°C，新鲜稀释（Sigma，目录号：M1567）
柠檬酸裂解酶
1 M Tris-HCl（pH 7.5 ）（Carl Roth，目录号：9090.4）
100 毫米氯化镁2
50 mM DTE，新溶解（Sigma，目录号：D8255）
100 mM柠檬酸盐（Sigma，目录号：C8532）
5 mM NADH，新鲜溶解（ Acros Organics，目录号：10711911）
200 U / mL猪苹果酸脱氢酶，储存在4°C，新鲜稀释（Sigma，目录号：M1567）
苹果酸脱氢酶
1 M Tris-HCl（pH 8）（Carl Roth，目录号：9090.4）
50 毫米氯化镁2
50 mM DTE，新溶解（Sigma，目录号：D8255）
25 mM草酰乙酸，在-20°C或-80°C下储存≤2个月（Sigma，目录号：04126）
5 mM NADH，新鲜溶解（ Acros Organics ，目录号：10711911）
丙酮酸合酶
1 M Tris-HCl（pH 7.5）（Carl Roth，目录号：9090.4）
100 毫米氯化镁2
50 mM DTE，新溶解（Sigma，目录号：D8255）
50 mM CoA （ Neofroxx ，目录号：2100GR005）
100 mM丙酮酸盐（Sigma，目录号：P2256）
10 mM甲基紫精（Sigma，目录号：856177）
2-氧戊二酸合酶
1 M Tris-HCl（pH 7.5）（Carl Roth，目录号：9090.4）
100 毫米氯化镁2
50 mM DTE，新溶解（Sigma，目录号：D8255）
50 mM CoA （ Neofroxx ，目录号：2100GR005）
100 mM 2-酮戊二酸（Sigma，目录号：75890）
20 mM苄基紫精（Sigma，目录号：D8130）

同位素分析（基于 GC-MS 分析）
玻璃小瓶，1.5 mL（VWR，目录号：548-0018）
用于 GC/MS 小瓶的螺帽（VWR，目录号：548-0814）
玻璃入口，200 µL（VWR，目录号：548-0780）
微量离心管，2 mL（VWR，目录号：525-0228）
玻璃巴斯德移液器，短型（ Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH & Co. KG，目录号：40567001）
超细玻璃棉（ Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH & Co. KG，目录号：41408003）
盐酸，37%（Sigma，目录号：320331）
乙酸，≥99％（Sigma，目录号：A6283）
Dowex 50WX8 200-400（H ± ）（Alfa Aesar，目录号：L13922.18）
甲醇，99.8%（Sigma，目录号：322415）
氨水溶液，25％（Merck，目录号：1054321000）
无水乙腈，99.8%（Sigma，目录号：271004）
N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺≥95％，含有1％叔丁基二甲基氯硅烷（MTBSTFA）（Sigma，目录号：375934），储存于-20℃

设备

厌氧菌培养实验
秤
燃气管道系统
膜真空泵（ Vacuubbrand ，目录号：19137003）
乙烯基厌氧室（Coy 实验室产品）或同等产品
瓶口分配器（品牌，目录号：4600360）或同等产品
pH Meter SevenCompact S210（Mettler Toledo，目录号：30130862）或同等产品
恒温摇床 New Brunswick Innova ® 44R（Eppendorf，目录号：M1282-006）或等效的温控摇床
光学显微镜（蔡司，型号： Axiostar ）或同等产品
Thoma细胞计数室（VWR，目录号：631-0697）

生物质的收获和细胞提取物的制备
Sorvall离心机 RC6+（Thermo Fisher Scientific，目录号：46915）或同等产品
固定角转子 F9-4x1000y（Thermo Fisher Scientific，目录号：096-041032）
台式离心机 5810/5810 R（Eppendorf，目录号：5811000015）或同等产品
转子 A-4-81（Eppendorf，目录号： 5810718007)
台式微量离心机 5417R (Eppendorf)或同等产品
转子 F45-30-11 (Eppendorf)
电动移液器（Eppendorf，型号： Easypet ）或同等产品
乙烯基厌氧室（Coy 实验室产品）或同等产品
光学显微镜（蔡司，型号： Axiostar或同等产品）
超声波均化器 Sonopuls （BANDELIN 电子，目录号：2451）或同等产品
铝制冷却块
-80°C 冰箱

酶测定
Cary 3500 紫外-可见分光光度计（安捷伦）或同等产品；请注意，使用嗜热菌需要一个温度控制的比色皿支架（在我们的例子中是风冷 Peltier 温度控制）
比色皿，400 µ L，光程 10 mm（ Hellma ，目录号：115-10-40）或等效物
注射器 Hamilton，50 µL（Carl Roth，目录号：X048.1）或同等产品
比色皿的橡胶塞
乙烯基厌氧室（Coy 实验室产品）或同等产品
Thermomixer（Eppendorf，型号：comfort）或同等产品
真空泵
超声波浴（BANDELIN electronic，型号：DT 100）或同等产品
超高效液相色谱仪 (UHPLC)（安捷伦，型号：1290 Infinity II LC 系统）或同等学历
反相液相色谱分离柱（相 EC-C18）（Agilent，目录号：699675-902）或同等产品
移液器套件 (RAININ) 或同等产品

同位素分析（基于 GC-MS 分析）
冻干机 Alpha 2-4 LDplus （Martin Christ，Osterode，德国）或同等产品
烤箱（Binder，E28 型，德国图特林根）或同等产品
加热块 Techne ® DRI Block DB 2A（默克，达姆施塔特，德国）或同等产品
GCMS-QP 2010 plus 带自动进样器 AOC20i （Shimadzu，杜伊斯堡，德国）或同等产品
硅胶毛细管柱（Equity TM-5；30 m x 0.25 mm；0.25 µm 薄膜厚度；Sigma-Aldrich， Supelco ，目录号 28098-U）

软件

交互式密码子分析 INCA 软件（ Supek和Vlahovicek ，2005； http: //bioinfo.hr/software-tools/ ）
国家生物技术信息中心(NCBI) BLAST ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ )
（岛津， https: //www.shimadzu.de/labsolutions % E2 % 84 % A2-lcms-software-simple-analytical-platform ）
同位素（Ahmed等人，2014 年， https: //www.uni-wuerzburg.de/tr34/software-developments/isotopo/ ）
微软 Excel（微软，2016， https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel ）

程序

厌氧菌培养实验
请注意，气体的使用是根据我们管道系统的规格描述的。特别是，手动添加 CO 2需要一个无菌注射器（公鲁尔锁）、一个鲁尔到管道连接器（母鲁尔锁），以及专门用于13 CO 2气体的讲瓶控制阀连接到碳钢讲座瓶（参见材料和试剂 A）。
不同CO 2浓度下的生长
mL 总体积；20 mL、5 mL 和 2 mL 培养基）中培养厌氧微生物。
脱硫菌科栽培见配方1）种）。请记住，报告的成分列表可能与适合培养其他自养生物的成分列表不同。
2 （50–100 kPa 过压）执行真空气体循环（通常每次 1 分钟）约 40 分钟（见注 5），使溶液缺氧。
在最终浓度为 0.05% (w/v) 时添加 Na 2 S∙9H 2 O来减少溶液。
将培养基的 pH 值调整到相关生物体的最佳生长状态。事实上，由于硫化钠的添加使介质 pH 值呈碱性（在我们的例子中 pH 值约为 8），因此有必要通过添加缺氧的 HCl 溶液来调节它（见注 5）。如果与生长培养基相容，可以使用其他酸。请考虑不同的培养基成分可能会影响产生的 pH 值，并与我们的经验不同。
除去培养基瓶中的过压，然后将其转移到厌氧室（参见注释 3，了解不使用厌氧室的另一种等分方式）。
在瓶分配器的帮助下对介质（20 mL、5 mL 和 2 mL）进行分装。培养减硫剂时，将元素硫粉（10 g L -1 ）预先分配到血清瓶中。
用丁基橡胶塞封闭血清瓶，然后将它们转移出厌氧室，并用压接铝盖密封。
在 110°C 高压灭菌含硫介质 40 分钟。高压灭菌的培养基可以长期保存在 RT 中。请记住，用于培养其他自养微生物的培养基可能需要不同的灭菌温度。
接种前，将无菌过滤维生素（见配方 3）添加到培养物中并更换气相。由于热敏感性，在灭菌前通常不向培养基中添加维生素。将 40 mL 维生素溶液转移到血清瓶中，使其缺氧（见注 5），然后使用无菌一次性注射器和针头将维生素厌氧添加到培养基中，最终浓度为 10 mL L - 1 。
2执行真空气体循环来替换新鲜培养物的气相。在添加 CO 2之前，释放培养物中存在的任何超压。
添加 CO 2：20 mL 培养物为 80 kPa 或 40 kPa，5 ml 培养物为 10 kPa，5 mL 培养物为 4 kPa，2 mL 培养物为 2 kPa。
填充 H 2至 100 kPa 过压。
如有必要，使用缺氧 1 M 将 pH 值调节至有机体最佳状态 NaOH（见注 5）。这很重要，因为添加 CO 2会使培养基酸化（CO 2 + H 2 O ⇋ H 2 CO 3 ⇋ 〖"HCO" 〗_"3" ^"-" + H + )。
对于接种，在指数后期使用积极生长的培养物，以尽量减少滞后期。在我们的例子中，起始细胞密度为 10 6 [细胞/mL]。在最佳生长温度下搅拌主要培养物（图 1A）。

碳 13 标记实验
1 L 输液瓶（200 mLmedium ）中存在碳 13 化合物的情况下厌氧微生物的培养。
解决成分（见脱硫菌科栽培配方1 ）种）。请记住，报告的成分列表可能与适合培养其他自养微生物的成分列表不同。
在量筒的帮助下分装介质 (200 mL)。培养减硫剂时，将单质硫粉（10 g L -1 ）预先分配到1 L输液瓶中。用橡胶塞和铝盖封闭瓶子。
2 （50-100 kPa 过压）进行真空气体循环（通常每次 1 分钟）约 15-20 分钟（见注 5），使培养物缺氧。
最终浓度为 0.05% (w/v)的 Na 2 S∙9H 2 O来减少培养物。
将培养基的 pH 值调整到相关生物体的最佳生长状态。事实上，由于硫化钠的添加使介质 pH 值呈碱性（在我们的例子中 pH 值约为 8），因此有必要通过添加缺氧的 HCl 溶液来调节它（见注 5）。如果与生长培养基相容，可以使用其他酸。请考虑不同的培养基成分可能会影响产生的 pH 值，并与我们的经验不同。
在 110°C 高压灭菌含硫介质 40 分钟。高压灭菌的培养基可以长期保存在 RT 中。请记住，用于培养其他自养微生物的培养基可能需要不同的灭菌温度。
接种前，将无菌过滤维生素（参见程序 A1j）添加到培养物中。
根据以下说明添加示踪剂（i： 13 CO 2，或 ii：[1- 13 C]谷氨酸）。
13 CO 2 :
2执行真空气体循环来替换新鲜培养物的气相。在添加13 CO 2之前，释放培养物中存在的任何超压。用注射器手动添加13 CO 2 (99% 碳 13) 至 40 kPa 的最终分压，并用 H 2填充至 100 kPa 超压。
[1- 13 C]谷氨酸：
将气相替换为 H 2 :CO 2 (80:20; carbon-12) 并将 [1- 13 C]谷氨酸盐添加到培养基中，最终浓度为 14 mg L -1 。
如有必要，使用缺氧 1 M 将 pH 值调节至有机体最佳状态 NaOH（见注 5）。这很重要，因为添加 CO 2会使培养基酸化（CO 2 + H 2 O ⇋ H 2 CO 3 ⇋ 〖"HCO" 〗_"3" ^"-" + H + )。
对于接种，在指数后期使用积极生长的培养物，以尽量减少滞后期。请注意，在我们的案例中，起始细胞密度为 10 6 [细胞/mL]。在最佳生长温度下搅拌主要培养物（图 1B）。

图1。在孵化器摇床中进行厌氧培养。
A.装有 20 mL 培养基的血清瓶。 B.装有 200 mL 培养基的输液瓶。两种培养物都含有元素硫的悬浮液。

生物质的收获和细胞提取物的制备
在中期指数生长期间收获细胞以进行酶活性测量，并在后期指数生长期间收获细胞以进行 GC-MS 分析。识别在指数生长期后期，我们使用Thoma细胞计数室（见注释 7 和数据分析 A2）对培养基中的细胞进行计数，并将结果与相应生物体测量的生长曲线进行比较。在我们的案例中，文化通常达到生长 48-96 小时后的指数后期生长阶段。
离心前分离元素硫和细胞，释放超压，打开瓶子，在好氧条件下用折叠过滤器和漏斗过滤培养基。请注意，最好在通风橱下执行此程序，尤其是在硫还原剂产生 H 2 S 作为代谢副产物的情况下。
将过滤后的培养物离心（15,000 × g ，4°C，20 分钟）并小心弃去上清液。请注意，某些生物的细胞沉淀可能很容易重新悬浮。为了获得更好的结果，可以使用电子移液器在此过程中丢弃上清液。
用大约 20 mL 的剩余培养基重新悬浮细胞颗粒，并将细胞悬浮液转移到 50 mL 离心管中。
离心细胞悬液（3,000 × g ，4°C，40 分钟）并小心弃去上清液。
用 1 mL 的 0.9% [w/v] NaCl 溶液（盐水）重新悬浮细胞颗粒，并将细胞悬浮液转移到 2 mL 微量离心管中。
离心细胞悬液（ 21,000 × g ，4°C，20 分钟）并小心弃去上清液。
用液氮冷冻细胞沉淀并将其储存在 -80°C，或破坏细胞以进行进一步测试。
在后一种情况下，将带有细胞颗粒的微量离心管转移到厌氧室。
用 500 μL 的缺氧细胞裂解缓冲液重新悬浮细胞颗粒（参见配方 5）。用冷却的铝块保持溶液冷却。
用超声波均质器裂解细胞（60% 振幅，4 分钟运行，1-s 脉冲，2-s 中断；总能量输入为 2，000 kJ）。特别是对于氧敏感酶（即丙酮酸合酶和2-酮戊二酸合酶），在厌氧室或厌氧环境中进行缺氧打开细胞是至关重要的。
, 000 × g , 4°C, 20 分钟)去除不溶性细胞碎片。
确定蛋白质浓度 (Bradford, 1976)，然后在冰上处理。细胞提取物适合大约 3 – 4 小时的工作。在-20 °C 下长期储存会损害酶的稳定性。

酶测定
在以下程序中，给出了反应组分的最终浓度。建议的储备浓度列在材料和试剂部分 C。在进行检测之前，请考虑以下实用建议：开始与底物的酶促反应；根据相关生物的最佳生长温度选择测试温度，并假设温度升高 10°C，反应速率加倍；高温可能会损害反应混合物中存在的化学物质的稳定性；在分光光度测量的情况下，请注意所使用设备的最大吸光度限制。
测试至少两种不同浓度的细胞提取物以获得活性对添加酶量的线性依赖性。对于 roTCA 循环的高活性酶（即柠檬酸合酶和苹果酸脱氢酶）的测量，如果研究的生物体具有该循环，则只需将少量细胞提取物添加到反应混合物中。在我们的例子中，0.5 – 1 (µg protein∙mL -1 ) 的细胞提取物足以获得线性活性。这对应于在柠檬酸合成方向（草酰乙酸 + 乙酰辅酶 A + H 2 O →柠檬酸 + CoA）或苹果酸方向上的柠檬酸合酶测定中每分钟吸收 0.3 到 0.7 个单位的差异 ( Δabs ∙min -1 )草酰乙酸还原方向的脱氢酶（草酰乙酸 + NADH + H + →苹果酸 + NAD + )。然而，柠檬酸合酶在柠檬酸裂解方向上的活性要低得多（柠檬酸 + 辅酶 A →乙酰辅酶 A + 草酰乙酸 + H 2 O），因此需要混合物中的高蛋白质浓度（在我们的例子中，至少高出 20 倍） .如果化验结果不明确，则可以通过用水代替细胞提取物或底物来进行额外的阴性对照。
在我们的例子中，反应混合物的最终体积为 300 µL。
柠檬酸合酶（正向反应，分光光度连续测定，λ=412 nm）
在由以下组成的反应混合物中测量柠檬酸合酶的活性：
100 mM Tris-HCl (pH 7.5)
1 毫米 DTNB
0.5 mM 乙酰辅酶A
5 mM 草酰乙酸
细胞提取物
dH 2 O
将分光光度计的比色皿架预热到测试温度。
将除草酰乙酸以外的所有反应混合物组分添加到比色杯中，以达到 300 μL的最终体积。
用移液器彻底混合反应混合物。
开始测量并获得稳定的基线。
随着基线稳定，等待 1 分钟以记录背景活动，然后通过添加 5 mM 草酰乙酸开始反应。使用 DTNB (ε 412 =14.2 mM -1 cm -1 [Riddles et al ., 1979]) 作为试剂，监测乙酰辅酶 A 中游离 CoA 的草酰乙酸依赖性形成。
柠檬酸合酶（逆向反应，分光光度连续测定，λ=365 nm）
在由以下组成的反应混合物中测量逆向反应中柠檬酸合酶的活性：
1) 100 mM Tris-HCl (pH 7.5)
2) 5 毫米 DTE
3) 5 毫米氯化镁2
4) 0.5 毫米辅酶A
5) 0.5 毫米 NADH
6) 20 毫米柠檬酸盐
7) 20 U/mL 猪苹果酸脱氢酶
8)细胞提取物
9) dH 2 O
将分光光度计的比色皿架预热到测试温度。
将除柠檬酸盐外的所有反应混合物组分添加到比色杯中，以达到 300 μL的最终体积。
用移液器彻底混合反应混合物。
开始测量并获得稳定的基线。
随着基线稳定，等待 1 分钟以记录背景活动，然后通过添加 20 mM 柠檬酸盐开始反应。由于辅助酶苹果酸脱氢酶的活性，在柠檬酸合酶逆向反应中形成草酰乙酸，监测 NADH 的柠檬酸依赖性氧化（ε 365 =3.4 mM -1 cm -1 [ Bergmeyer ，1975]）。
柠檬酸合酶（逆向反应，UHPLC 不连续测定，λ=260 nm）
进行化验
在由以下组成的反应混合物中测量逆向反应中柠檬酸合酶的活性：
1) 100 mM Tris-HCl (pH 7.5)
2) 5 毫米 DTE
3) 5 毫米氯化镁2
4) 0.5 毫米辅酶A
5) 0.5 毫米 NADH
6) 20 毫米柠檬酸盐
7) 20 U/mL 猪苹果酸脱氢酶
8)细胞提取物
9) dH 2 O
将 1.5 mL 微量离心管的热混合器预热至测试温度。
在这种情况下，混合除柠檬酸盐以外的所有反应混合物组分。最终体积应确保四个时间点的正确采样（例如，最终体积为100 μL 四个 20 μL样品）。
彻底混合反应混合物并旋转下来。
在测试温度下将反应混合物预孵育 1 分钟，然后用 20 mM 柠檬酸盐开始反应。
取适量（t0）并立即停止反应（样品：停止溶液，1:1 [v/v]）。
同样，在1 分钟 (t1)、2 分钟 (t2) 和 10 分钟 (t10) 后取样，每次立即停止反应（样品：停止溶液，1:1 [v/v]）。
在测定过程中，保持样品冷却，然后用液氮冷冻并储存在-20°C。
UHPLC 运行
将样品离心两次（ 21,000 × g ，4°C，5 分钟）以去除不溶性蛋白质和颗粒。
在 2 mL 螺旋盖小瓶或 96 孔微孔板中准备 UHPLC 样品。如有必要，仅使用 UHPLC 级 ddH 2 O稀释样品。
在我们的案例中，CoA 酯使用配备 EC-C18 色谱柱的 1290 Infinity II UHPLC 系统进行反相 LC 分离（Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 1.9 µm 2.1 × 50 mm）。二极管阵列检测器（Agilent，灯目录号：G7117B）允许在 260 nm 处对 CoA 和不同 CoA-酯进行 UV 检测。
运行前，用 UHPLC 级 ddH 2 O 和磷酸钾缓冲液清洗泵，并将色谱柱平衡至起始条件（2% 乙腈 - 98% 磷酸钾缓冲液）。
对于实际的样品分析，使用以下色谱溶剂：溶剂 A、乙腈和溶剂 B、磷酸钾水溶液（pH 7）（参见配方 7）。使用梯度洗脱进行色谱：注射后，在 2.66 分钟内将乙腈的浓度从 2% 增加到 8%，在 3.33 分钟内增加到 30%，然后在 3.68 分钟内将其降低到 2%，并保持等度直至 5.00 分钟.保持流速恒定在 0.55 m L min -1 。
ATP-柠檬酸裂解酶（分光光度连续测定，λ=365 nm）
在由以下组成的反应混合物中测量 ATP-柠檬酸裂解酶的活性：
1) 100 mM Tris-HCl (pH 7.5)
2) 5 毫米氯化镁2
3) 5 毫米 DTE
4) 0.5 毫米辅酶A
5) 0.4 毫米 NADH
6) 20 毫米柠檬酸盐
7) 0.5 毫米三磷酸腺苷
8) 20 U/mL 猪苹果酸脱氢酶
9) 细胞提取物
10) dH 2 O
将分光光度计的比色皿架预热到测试温度。
将除 ATP 之外的所有反应混合物组分添加到比色皿中，以达到 300 μL的最终体积。
用移液器彻底混合反应混合物。
开始测量并获得稳定的基线。
随着基线稳定，等待 1 分钟以记录背景活动，然后通过添加 0.5 mM ATP 开始反应。由于混合物中存在的帮助酶苹果酸脱氢酶的活性，通过监测 NADH 氧化 (ε 365 =3.4 mM -1 cm -1 [ Bergmeyer , 1975]) 来测量草酰乙酸的形成。
柠檬酸裂解酶（分光光度连续测定，λ=365 nm）
在由以下组成的反应混合物中测量柠檬酸裂合酶的活性：
1) 100 mM Tris-HCl (pH 7.5)
2) 5 毫米 DTE
3) 5 毫米氯化镁2
4) 0.5 毫米 NADH
5) 20 毫米柠檬酸盐
6) 20 U/mL 猪苹果酸脱氢酶
7) 细胞提取物
8) dH 2 O
将分光光度计的比色皿架预热到测试温度。
将除柠檬酸盐外的所有反应混合物组分添加到比色皿中，以达到 300 μL的最终体积。
开始测量并获得稳定的基线。
随着基线稳定，等待 1 分钟以记录背景活动，然后通过添加 20 mM 柠檬酸盐开始反应。由于混合物中存在的帮助酶苹果酸脱氢酶的活性，测量草酰乙酸形成监测 NADH 氧化（ε 365 =3.4 mM -1 cm -1 [ Bergmeyer ，1975]）。
苹果酸脱氢酶（分光光度连续测定，λ=365 nm）
在由以下组成的反应混合物中测量苹果酸脱氢酶的活性：
1) 100 mM Tris-HCl (pH 8)
2) 5 毫米 DTE
3) 5 毫米氯化镁2
4) 0.5 NADH
5) 2.5 mM 草酰乙酸
6) 细胞提取物
7) dH 2 O
将分光光度计的比色皿架预热到测试温度。
将除草酰乙酸以外的所有反应混合物组分添加到比色皿中，以达到 300 μL的最终体积。
用移液器彻底混合反应混合物。
开始测量并获得稳定的基线。
随着基线稳定，等待 1 分钟以记录背景活动，然后通过添加 2.5 mM 草酰乙酸开始反应。测量 NADH 的氧化（ε 365 =3.4 mM -1 cm -1 [ Bergmeyer ，1975]）。
丙酮酸合酶（分光光度厌氧连续测定，λ=578 nm）
丙酮酸合酶反应需要还原条件。添加连二亚硫酸盐以减少紫精，直到溶液略呈蓝色（578 nm 处的吸光度约为 0.8），然后继续。有一种替代方法可以在不使用厌氧帐篷的情况下进行该测试（见注 6）。
在由以下组成的反应混合物中测量丙酮酸合酶的活性：
1) 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)
2) 5 毫米氯化镁2
3) 2.5 毫米 DTE
4) 0.5 毫米辅酶A
5) 1 mM 甲基紫精
6) 10 mM 丙酮酸
7) 细胞提取物
8) dH 2 O
将分光光度计的比色皿架预热到测试温度。
在厌氧帐篷中工作时，将除丙酮酸外的所有缺氧反应混合物组分添加到比色皿中，以达到 300 μL的最终体积。
用移液器彻底混合反应混合物。
用橡胶塞关闭比色皿，然后将其移出帐篷。
2替换比色皿的气相。
开始测量并获得稳定的基线。
随着基线稳定，等待 1 分钟以记录背景活动，然后使用Hamilton 注射器添加 10 mM 丙酮酸开始反应。监测甲基紫精的丙酮酸依赖性还原（ε 578 nm=9.7 mM -1 cm -1 [Dawson et al ., 1986]）。
2-氧代戊二酸合酶（分光光度厌氧连续测定，λ=578 nm）
2-氧代戊二酸合酶反应需要还原条件。添加连二亚硫酸盐以减少紫精，直到溶液略呈蓝色（578 nm 处的吸光度约为 0.8），然后继续。请注意，有另一种方法可以在不使用厌氧帐篷的情况下进行该测试（见注 6）。
在由以下组成的反应混合物中测量 2-氧代戊二酸合酶的活性：
1) 100 mM Tris-HCl (pH 7.5)
2) 5 毫米氯化镁2
3) 2.5 毫米 DTE
4) 0.5 毫米辅酶A
5) 1 mM 苄基紫精
6)10 mM 2-酮戊二酸
7) 细胞提取物
8) dH 2 O
将分光光度计的比色皿架预热到测试温度。
在厌氧帐篷中工作时，将除 2-酮戊二酸以外的所有缺氧反应混合物成分添加到比色皿中，以达到 300 μL的最终体积。
用移液器彻底混合反应混合物。
用橡胶塞关闭玻璃比色皿，然后将其移出帐篷。
2替换比色皿的气相。
开始测量并获得稳定的基线。
随着基线稳定，等待 1 分钟以记录背景活动，然后通过添加 10 mM 2-oxoglutarate 开始反应。监测苄基紫精的 2-氧代戊二酸依赖性还原（ε 578 nm=9.7 mM -1 cm -1 [Dawson et al ., 1986]）。

同位素分析（基于 GC-MS 分析）
使用冷冻干燥机冻干细菌细胞颗粒。为确保干燥，通常将样品干燥过夜。
将 2 mg 干燥样品转移到 1.5 mL 玻璃瓶中。
加入 500 µL 的 6 M HCl（水溶液）并在 105°C 下孵育样品 15 小时，以对细胞蛋白进行酸性水解。
在 70°C 的加热块中，在氮气流下干燥样品约 45 分钟。
将 200 μL 的 50% 乙酸（水溶液）添加到干燥的残留物中，并通过剧烈涡旋小瓶 10 秒来重新溶解样品。
准备用于氨基酸分离的阳离子交换柱。
用玻璃棉填充 1 mL 移液器尖端的下五分之一。
在玻璃棉上添加 200 μL 的 Dowex。
用 1 mL 的 70% MeOH（水）和 1 mL 的 ddH 2 O洗脱柱。
在柱下方放置一个 2 mL 微量离心管以收集水相。
使用 150 mm 巴斯德吸管小心地将样品加入色谱柱，不要淘洗色谱柱材料。
样品渗入色谱柱后，将 800 µL H 2 O 填充到初始样品瓶中，并使用步骤 8 中的巴斯德移液器将这部分水添加到色谱柱中。
添加另一个 800 μL 的 ddH 2 O 之后，首先应用的量（步骤 9）已经渗透到列中。
在整个水性洗脱液从色谱柱中渗出后，在其下方放置一个 1.5 mL 玻璃小瓶以收集碱性洗脱液。
将 1 mL 的 4 M 氨溶液（水溶液）涂在色谱柱上。
在 70°C 的加热块中，在氮气流下干燥碱性洗脱液约 50 分钟。
对于氨基酸的衍生化，在干燥的碱性残渣中加入 50 μL 的无水乙腈和 50 μL 的 MTBSTFA。
将混合物在加热块中于 70°C 孵育 30 分钟，然后将其转移至 200 µL 玻璃入口。
对于 GC/MS 测量，在接口温度为 260°C 的进样器中以分流模式 (1:5) 注入等分试样 (0.1 – 5 µL)。
将色谱柱保持在 150°C 3 分钟，然后以 7°C/分钟的梯度将温度升高到最终的 280°C。再保持此温度 3 分钟。
使用选定的离子监测 (SIM) 测量样品一式三份。对于每个片段（质量 M，仅包含12 C），测量从 M-1 到 M+X+4 的离子迹线的强度，其中 X 是相应片段中的碳数。
使用Labsolutions集成各个信号。
等人的说法，通过与未标记的样品进行比较，计算出总的13 C 过量以及每个片段中的同位素组成。（2014）。
13 C 过量或标记分子的百分比可以用柱形图表示，而同位素体组成理想情况下使用 Excel 2016 显示为堆叠的 100% 列。

数据分析

不同CO 2浓度增长实验
每个测试的 CO 2浓度至少使用三个重复培养物进行生长实验，并将结果显示为平均值 ± SEM
从接种开始，每 24 小时计数一次细胞，直到培养物达到静止期。请记住，其他物种的世代时间可能不同；因此，应选择其他细胞计数间隔。
在使用 roTCA 循环的生物体的情况下，生长应强烈依赖于 CO 2浓度。在我们的案例中，测试的脱硫菌科显示出大约 1.5 – 2 倍的延长世代时间 { gt = (t 2 -t 1 ) /( 3.3*lg [细胞密度2 /细胞密度1 )]}，CO 2从 40% 下降到 5%。在这些 CO 2浓度下， H. maritima的生成时间分别为 17 和 30 小时， D. acetivorans 8 和 13.5 小时， D. propionica 9 和 18 小时，以及D. multipotens 10 和 13.5 小时（Steffens等等人，2021 年）。
根据 CO 2分压，最终的细胞密度也应表现出类似的依赖性，最终在 2% 和 1% CO 2的情况下达到中等或不可检测的增长。

酶测定
对中枢代谢酶的活性测定进行至少两次生物重复，并为每个生物重复进行至少三个技术复制。技术复制不应是相同的测定，而是反应对反应混合物中存在的酶量的依赖性的证明。为此，请测试不同浓度的细胞提取物。所得的测量结果应显示更高的活性率 [ΔAbs∙min -1 ] 随着酶浓度的增加而增加，但保持大致相同的比活性 [µmol∙min -1 ∙mg -1蛋白质]。
酶的比活性通常报告为反应混合物中每毫克蛋白质每分钟转化的μmol底物（即，比活性 [µmol∙min -1 ∙mg -1蛋白质]）。
在分光酶测定的情况下，使用 Lambert-Beer 定律计算活性：c = A∙ε -1 ∙d -1 ，其中 ε 是摩尔消光系数 [M -1 ∙cm -1 ]，d 是光程长度 [cm]，c 是衰减物质的浓度，通常是消耗的底物或形成的产物。
首先，确定每分钟的吸光度变化 [ΔA∙min -1 ]。
将吸光度变化除以相应的消光系数和光程长度（通常为 1 cm），得到每分钟的浓度变化 [M∙min -1 ]。重新计算毫摩尔浓度（即除以 1,000），这相当于 [µmol∙ml -1 ∙min -1 ] 中的酶活性。
乘以被测酶制剂/细胞提取物的稀释倍数（例如，5% [v/v] 细胞提取物的测试代表稀释倍数为 20）。如果酶溶液被稀释，也要考虑这种稀释。
最后，通过将反应混合物 [µmol∙mL -1 ∙min -1 ]中获得的总活性除以蛋白质浓度 [mg 蛋白质∙mL -来计算 [µmol∙min -1 ∙mg -1蛋白质] 中的比活性1 ]，由 Bradford 方法确定（参见程序 B13）。
在柠檬酸盐裂解不连续测定（UHPLC；柠檬酸盐 + CoA → 乙酰-CoA + 草酰乙酸 + H 2 O）的情况下，峰与乙酰-CoA 和 CoA 标准的保留时间相关（图 2A 和 2B）。这两种物质在 260 nm 处的光谱可用于区分游离 CoA 和 CoA 硫酯（图 2C）。
和乙酰辅酶 A 峰的积分面积来计算比活性。由于 CoA 和乙酰-CoA 具有大致相同的消光系数（分别为 16.3 和 16.4 mM -1 cm -1 ），因此可以将初始 CoA 浓度乘以形成的乙酰-CoA 的相对丰度 [%]，得到在相应的时间点获得其在反应混合物中的浓度。
一旦计算出乙酰辅酶 A的浓度 [µmol∙mL -1 ]，将其除以反应停止的分钟 [min -1 ]。
将总活性乘以稀释因子 [µmol∙mL -1 ∙min -1 ]。如果酶溶液被稀释d，也要考虑这种稀释。
为了最终获得比活性 [µmol∙min -1 ∙mg -1蛋白质]，将总活性除以酶浓度 [mg∙ml -1 ]，由 Bradford 方法确定（参见程序 B13）。
对于使用 roTCA 循环的生物体，预计柠檬酸合酶和苹果酸脱氢酶活性 >10 [µmol∙min -1 ∙mg -1蛋白质]。

图 2。柠檬酸合酶进行的柠檬酸裂解反应（折扣试验）。
A.报告了两种标准品（游离 CoA 和乙酰-CoA）的 UHPLC 色谱图以及相应的保留时间（分别为 0.864 和 1.617 分钟）。 B.两个时间点的 UHPLC 色谱图：在反应开始 (0 分钟) (柠檬酸盐 + CoA →乙酰-CoA + 草酰乙酸 + H 2 O) 时立即取样，加入自养生长H的细胞提取物. maritima， 10 分钟后。 C.标准品（红色）和样品（蓝色）在 260 nm 处乙酰辅酶 A 和辅酶 A 峰的吸收光谱比较。

同位素分析（基于 GC-MS 分析）
检查图 3 以概述为跟踪 roTCA 循环活动而执行的标记实验的分析。天冬氨酸和谷氨酸可替代直接 roTCA 循环中间体草酰乙酸和 2-氧代戊二酸。
在使用13 CO 2作为示踪剂的实验中（图 3A），分析天冬氨酸和谷氨酸的同位素组成可以直接了解 roTCA 循环活动；虽然只有循环的选定部分结合了13 CO 2时，也可能产生较轻的同位素体（在查看以 [1- 13 C]谷氨酸作为示踪剂的实验时（图 3B），比较标记分子在天冬氨酸和谷氨酸的不同片段中的百分比用作 roTCA 循环活性的读数。在活跃的 roTCA 循环的情况下，标记从谷氨酸的 C1 转移到天冬氨酸的 C4。随后，含有 C1-4 或 C2-4 的天冬氨酸片段显示相同百分比的标记分子。通过 roTCA 循环的进一步传播在谷氨酸的 C2 或 C5 位置诱导标记，最初仅在 C1 位置标记。

图 3。分析标记实验以跟踪 roTCA 循环活动。
A.分别在三轮和四轮 roTCA 循环后将13 CO 2结合到天冬氨酸和谷氨酸中，产生不同的同位素体。直方图显示了检测到的同位素体的相对丰度。根据直方图的图例，标记的碳示意性地表示为彩色圆圈。 B. [1- 13 C]谷氨酸通过 roTCA 循环后，比较标记分子在谷氨酸（蓝色：C1-5；绿色：C2-5）和天冬氨酸（蓝色：C1-4）的不同片段中的百分比；绿色：C2-4)。化学结构中的彩色条表示相应片段中分子的部分。 AcCoA ：乙酰辅酶A； Pyr ：丙酮酸； OAA：草酰乙酸； Asp：天冬氨酸； Succ ：琥珀酸盐； 2-OG：2-酮戊二酸； Glu：谷氨酸；柠檬酸盐：柠檬酸盐。数据是至少三个生物学重复的平均值±SEM。

笔记

使用其他 CO 2固定途径的自养生物在生长实验中可能不会表现出相同的浓度依赖性。因此，它们可能被排除在进一步分析之外。例如，如前所述，脱硫杆菌使用该循环（ rTCA循环）的 ATP-柠檬酸裂合酶变体的嗜氢杆菌在所有测试的生长条件下同样生长良好。对于其他自养生物，没有系统地研究使用rTCA循环的细菌的 CO 2浓度的生长独立性。
请注意，在实际无菌过滤之前，过滤器（无菌注射器过滤器；膜过滤器）应使用 20 mL 0.9% [w/v] NaCl 溶液（盐水）和 20 mL ddH 2 O 进行洗涤步骤，以去除任何过滤材料中可能存在的污染物（例如甘油）。
通过使用一次性注射器和针头将培养基从缺氧培养基转移到厌氧血清瓶，可以在不使用厌氧帐篷的情况下分装培养基。
培养物变成粉红色（刃天青氧化）通常表明存在氧气污染或强烈的 pH 变化。 Resofurin是导致粉红色着色的反应中间化合物，通常具有细胞毒性，并且变成粉红色的培养物可能已经死亡。
在我们的例子中，术语缺氧表示不含分子氧的溶液。要使溶液缺氧，请在搅拌下应用真空氮气循环（每次1-3 分钟，取决于体积）。作为一般规则，每升溶液40 – 45 分钟是此过程所需的最短时间。随后添加还原剂（在本协议中，仅在培养基的情况下）确保溶液完全不含分子氧。
执行这些厌氧酶测定不一定需要厌氧手套箱。可以有氧混合反应混合物的所有组分，用橡胶塞封闭比色皿，然后用 N 2冲洗气体空间。在用连二亚硫酸盐还原紫精直到溶液略带蓝色（在 578 nm 处吸光度约为 0.8）后，加入细胞提取物并继续。或者，也可以使每个溶液组分缺氧，如注释 5 所述，并在比色杯中厌氧混合，通过冲洗 N 2 （约 1 分钟）使其缺氧。然而，他的方法很难用于低活性酶的测量，因为在塞子中溶解的氧气可能会影响这种测定。
可以使用Thoma计数室计算培养物的细胞密度（细胞/mL）。它通常有两个计数区域，位于定义的深度（0.1 毫米），由 16 个大正方形组成，以三条平行线为界。每个大方格由16个小方格（0.0025 mm 2 ）组成，用于实际计数。
在样品应用之前，将盖玻片放在干净的Thoma室上，在外杆上施加温和的压力，直到形成牛顿环。如有必要，稀释样品，然后用移液器在计数区域附近缓慢加载。水的表面张力将有助于正确加载样品。找到带有 PH1 10 ×物镜的计数区域，然后移动到 PH2 40 ×物镜。请记住，腔室太厚而不能与浸油一起使用。每次使用后，必须用 70% [v/v] EtOH 彻底清洁腔室。
从左上角的小方块开始计数，然后以蛇形图案向右进行。计算位于小正方形内和相邻两侧（左上或右下）的单元格。分裂细胞计为两个。要发现位于不同平面上的所有单元格，请更改焦点（失焦-锐利-失焦）。数四个大方块；单个大方块计数之间的最终差异不应高于 10 个细胞/方块。
确定细胞计数的平均值并计算细胞密度（细胞/mL）。计数室的实际容积为 0.004 mm 3 ，等于 0.004 μL （0.1 mm ∙ 0.0025 mm 2 ∙ 16 个小方块）。最后，将体积乘以 250，得到细胞/ μL ，然后乘以 1,000，得到细胞/ mL。
细胞/mL=平均细胞数∙稀释倍数∙ 2.5*10 5

食谱

海豌豆_ _ acetivorans 、 D. multipotens和D. propionica培养基
将列出的成分（硫和维生素除外）溶解在 700 mL 的 dH 2 O 中，然后加至 1 L。
H. maritima的成分列表（由DSMZ 培养基 854改良，pH 5.5 – 6.0）：
0.33 g L -1 NH 4 Cl
0.33 g L -1 CaCl 2 · 2H 2 O
0.33 g L 1 MgCl 2 · 6H 2 O
0.33 克·升-1氯化钾
0.33 g L -1 KH 2 PO 4
25 克升-1氯化钠
3 g L -1 MOPS 缓冲液
200 mg L -1酵母提取物
1 mg L -1刃天青
10 g L -1硫磺粉
10 ml L -1微量元素溶液（DSMZ 141）
10 ml L -1 Wolfe's 维生素溶液
D. acetivorans (pH 6.5 – 7.0)、 D . multipotens ( pH 6.8) 和D. propionica (pH 6.9 – 7.2)的成分列表（从 DSMZ 480 修改）：
0.33 g L -1 NH 4 Cl
0.33 g L -1 CaCl 2 · 2H 2 O
0.33 g L -1 MgCl 2 · 6H 2 O
0.33 克·升-1氯化钾
0.33 g L -1 KH 2 PO 4
3 克 L -1拖把
10 g L -1硫磺粉
1 mg L -1刃天青
1 mL L -1 SL-10 微量元素溶液
10 mL L -1 Wolfe's 维生素溶液
SL-10微量元素溶液
将成分溶解在dH 2 O中。
3 g L -1 FeCl 2 · 4H 2 O
70 mg L -1 ZnCl 2
100 mg L -1 MnCl 2 · 4H 2 O
4 mg L -1 CuCl 2 · 2H 2 O
24 mg L -1 NiCl 2 · 6H 2 O
36 mg L -1 NaMoO 4 · 2H 2 O
30 毫克 L -1 H 3 BO 3
224 mg L -1 CoCl 2 · 6H 2 O
填充高达 1,000 mL dH 2 O。
无菌过滤器（见注 2）并在 4°C 下储存。
沃尔夫维生素溶液 (DSMZ 141)
将成分溶解在dH 2 O中。
2 mg L -1生物素
2 mg L -1叶酸
10 mg L -1吡哆醇-HCl
5 mg L -1硫胺素-HCl
5 mg L -1核黄素
5 mg L -1烟酸
5 mg L -1 D-Ca-泛酸盐
0.1 mg L -1氰钴胺素
5 mg L -1对氨基苯甲酸
5 mg L -1硫辛酸
填充高达 1,000 mL dH 2 O。
无菌过滤器（见注 2）并储存在 4°C。
微量元素溶液 ( DSMZ 141)
首先，将 1.5 克次氮基三乙酸 (NTA) 溶解在 200 mL 的蒸馏水中。
用 KOH 将 pH 值调节至 6.5，然后溶解以下矿物盐：
3 g L -1 MgSO 4 ·7H 2 O
0.5 g L -1 MnSO 4 ·H 2 O
1 g L -1 NaCl
0.1 g L -1 FeSO 4 ·7H 2 O
0.18 g L 1 CoSO 4 ·7H 2 O
0.1 g L -1 CaCl 2 ·2H 2 O
0.18 g L -1 ZnSO 4 ·7H 2 O
0.01 g L -1 CuSO 4 ·5H 2 O
0.02 g L -1 KAl(SO 4 ) 2 ·12H 2 O
0.01 g L -1 H 3 BO 3
0.01 g L -1 Na 2 MoO 4 ·2H 2 O
0.03 g L -1 NiCl 2 ∙6H 2 O
0.3 mg L -1 Na 2 SeO 3 ·5H 2 O
0.4 mg L -1 Na 2 WO 4 ·2H 2 O
最后，用 KOH 将 pH 值重新调整至 7.0，并填充至 1,000 mL dH 2 O。
无菌过滤器（见注 2）并储存在 4°C。
细胞裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.8，5 mM DTE）
称重 242 mg Tris-HCl 和 77 mg DTE，并将它们溶解在 70 mL dH 2 O中。
例如，所讨论的生物体的最佳生长温度）下将 pH 值调整到 7.8 。
填充高达 100 mL 的 dH 2 O。
2 100%（50–100 kPa 过压；见注 5）执行真空气体循环 15 分钟，使溶液缺氧。
终止溶液（10% 乙腈，1 M HCl）
2 O中小心混合 2 mL 的乙腈 (99.8%) 和 2 mL 的 10 M HCl 。
存储在 RT。
磷酸钾缓冲液（10 mM KH 2 PO 4 /K 2 HPO 4 ，pH 7.0）和 UHPLC 级水
在 500 mL 的 ddH 2 O 中溶解0.34 g KH 2 PO 4和 0.57 g K 2 HPO 4以达到 10 mM 磷酸盐缓冲液的最终浓度。
过滤 500 mL 的 ddH 2 O，然后过滤 500 mL 的磷酸钾缓冲液（0.22 μm 膜过滤器）。
用超声波浴或真空泵将溶液脱气 5 分钟。
每次运行前准备新鲜的 UHPLC 级溶液。

致谢

为由 Deutsche Forschungsgemeinschaft （DFG，德国研究基金会）Project-ID BE 4822/5-1 to IAB 和 Project-ID 364653263–TRR 235 to WE资助的先前发表的工作（Steffens等人，2021 年）开发的和 TS 以及 Hans-Fischer Gesellschaft（慕尼黑）到 WE

利益争夺

作者没有利益冲突或竞争利益。

参考

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材料和试剂

厌氧菌培养实验
血清瓶 N20，120 mL（ MediPac ，目录号：10113100）或等效物
输液瓶，1 L（VWR，目录号：215-9243）或等效物
丁基橡胶塞 N20（ Glasgerätebau Ochs，目录号： 102049 ）或等效物
用于 1 L 输液瓶的橡胶塞 (ERIKS)
压接铝盖（WICOM，目录号：WIC 44580）或等效物
压接器（VWR，目录号：548-0073）
（VWR，目录号：548-0074）
螺丝顶，带孔 Ø 19 mm（VWR：目录号：MUEL14.076.04）
Duran烧瓶，1 L（VWR，目录号：SCOT818015403 ）
®橡胶塞烧瓶（ Glasgerätebau Ochs，目录号：444704）
演讲瓶控制阀（Sigma，目录号：Z146951）
无菌注射器，公Luer -Lock（Fisher Scientific，目录号：14955461）或等效物
Luer -to -tubing连接器，母Luer -Lock （Sigma，目录号：Z261580）
一次性使用的无菌 ERSTA 注射器，1 mL（Th. Geyer，目录号：6075936）或等效物
一次性针头（Carl Roth，目录号：X132.1）或等效物
无菌注射器过滤器，0.2 µm 孔径（VWR，目录号：514-0061）
Na 2 S·9H 2 O（Sigma，目录号：1313-84-4）；储存于 4°C
（Carl Roth，目录号： 9304.1 ）；在室温 (RT) 下储存
刃天青钠盐（Sigma，目录号：R7017）；存储在 RT
氢气（Air Liquide Deutschland，目录号：P0231L50R2A001）
二氧化碳气体（Air Liquide Deutschland，目录号： P0760L50R0A001)
二氧化碳 13 气体，99% 13 C（Sigma，目录号： 364592）
L-谷氨酸-1- 13 C ，99% 13 C （Sigma，目录号： 604968）
H. maritima培养基（从DSMZ 854 修改）（见配方 1）
D. acetivorans、D. multipotens和D. propionica培养基（由 DSMZ 480 修改）（参见配方 1）
SL-10 微量元素溶液（见配方 2）
沃尔夫维生素溶液（见配方 3）
微量元素溶液 (DSMZ 141)（见配方 4）

生物质的收获和细胞提取物的制备
折叠过滤器， Ø 240 mm（Whatman Schleicher & Schuell ，目录号：10311651）或同等产品
短杆漏斗（VWR，目录号：221-0180）或同等产品
带密封盖的离心瓶，1 L（Thermo Fisher Scientific，目录号：05-564-26）或同等产品
离心管，50 mL（VWR，目录号：21008-940）或同等产品
微量离心管，1.5 和 2 mL（VWR，目录号：72.690.001、72.689）或同等产品
血清移液管（Thermo Fischer Scientific，目录号：170350）或同等产品
液氮
0.9% [w/v] NaCl 溶液（盐水）
铝冷却块（Sigma，目录号：Z743486）
细胞裂解缓冲液（见配方 5）

酶测定
列出了反应混合物。工作时，我们建议将所有化学物质和帮助酶放在冰上。除非另有说明，否则所有列出的组分都用 dH 2 O 溶解或稀释。当因其稳定性而需要特别注意时，会报告推荐的储存条件或特殊说明（例如，在检测前刚溶解）。有机酸和ATP溶液的pH值应调至中性； Tris-HCl 缓冲液的 pH 值可以在 RT 进行调整，但请注意，当最终测试温度与 RT 不同时，pH 也会根据以下公式变化： ΔpKa /°C≈-0。 028（例如，温度每升高 1°C，Tris 溶液的 pH 值就会降低 0.028 个 pH 单位）。对于长期储存，有机化合物和 CoA 酯溶液应保持在 -20°C 或 -80°C，除非另有说明；所有缓冲液和盐溶液都可以保存在室温。根据先前描述的方法（Simon等人，1953），由相应的酸酐和 CoA 化学合成乙酰辅酶 A。
在我们的例子中，储备溶液的浓度如下：
柠檬酸合酶（正向反应，分光光度连续测定）
1 M Tris-HCl（pH 7.5）（Carl Roth，目录号：9090.4）
50 mM草酰乙酸，在-20°C或-80°C下储存≤2个月（Sigma，目录号：04126）
10 mM 乙酰辅酶A
10 mM 5,5-二硫代双-2-硝基苯甲酸（DTNB），新鲜溶于100 mM Tris-HCl（pH 7.5）（Sigma，目录号：D8130）
柠檬酸合酶（反向反应，分光光度连续测定）
1 M Tris-HCl（pH 7.8）（Carl Roth，目录号：9090.4）
50 毫米氯化镁2
50 mM二硫赤藓糖醇（DTE），新鲜溶解（Sigma，目录号：D8255）
5 mM CoA（ Neofroxx ，目录号：2100GR005）
200 mM柠檬酸盐（Sigma，目录号：C8532）
5 mM NADH，新鲜溶解（ Acros Organics ，目录号：10711911）
200 U / mL猪苹果酸脱氢酶，储存在4°C，新鲜稀释（ Sigma，目录号：M1567 ）
柠檬酸合酶（逆向反应，UHPLC 不连续测定）
1 M Tris-HCl（pH 7.8）（Carl Roth，目录号：9090.4）
50 毫米氯化镁2
50 mM DTE，新溶解（Sigma，目录号：D8255）
5 mM CoA （ Neofroxx ，目录号：2100GR005）
200 mM柠檬酸盐（Sigma，目录号：C8532）
5 mM NADH，新鲜溶解（ Acros Organics ，目录号：10711911）
200 U / mL猪苹果酸脱氢酶，储存在4°C，新鲜稀释（Sigma，目录号：M1567）
小瓶插入物，250 µL，拉尖玻璃（Agilent，目录号：5183-2085）
螺口样品瓶、2 mL 和螺帽（安捷伦）或同等产品
微孔板，无菌，96 孔（Greiner Bio-One，目录号：655161）或等效物
膜过滤器，0.22 µm 孔径（Sigma，目录号：GSWP04700）
无水乙腈，99.8%（Sigma，目录号：271004）
停止溶液（见配方 6）
UHPLC 级双蒸水（见配方 7）
磷酸钾缓冲液（见配方 7）
ATP-柠檬酸裂解酶
1 M Tris-HCl（pH 7.5）（Carl Roth，目录号：9090.4）
100 毫米氯化镁2
10 mM ATP，新鲜溶解（Sigma，目录号：A26209）
50 mM DTE，新溶解（Sigma，目录号：D8255）
50 mM CoA （ Neofroxx ，目录号：2100GR005）
100 mM柠檬酸盐（Sigma，目录号：C8532）
5 mM NADH，新鲜溶解（ Acros Organics，目录号：10711911）
200 UF / mL猪苹果酸脱氢酶，储存在4°C，新鲜稀释（Sigma，目录号：M1567）
柠檬酸裂解酶
1 M Tris-HCl（pH 7.5 ）（Carl Roth，目录号：9090.4）
100 毫米氯化镁2
50 mM DTE，新溶解（Sigma，目录号：D8255）
100 mM柠檬酸盐（Sigma，目录号：C8532）
5 mM NADH，新鲜溶解（ Acros Organics，目录号：10711911）
200 U / mL猪苹果酸脱氢酶，储存在4°C，新鲜稀释（Sigma，目录号：M1567）
苹果酸脱氢酶
1 M Tris-HCl（pH 8）（Carl Roth，目录号：9090.4）
50 毫米氯化镁2
50 mM DTE，新溶解（Sigma，目录号：D8255）
25 mM草酰乙酸，在-20°C或-80°C下储存≤2个月（Sigma，目录号：04126）
5 mM NADH，新鲜溶解（ Acros Organics ，目录号：10711911）
丙酮酸合酶
1 M Tris-HCl（pH 7.5）（Carl Roth，目录号：9090.4）
100 毫米氯化镁2
50 mM DTE，新溶解（Sigma，目录号：D8255）
50 mM CoA （ Neofroxx ，目录号：2100GR005）
100 mM丙酮酸盐（Sigma，目录号：P2256）
10 mM甲基紫精（Sigma，目录号：856177）
2-氧戊二酸合酶
1 M Tris-HCl（pH 7.5）（Carl Roth，目录号：9090.4）
100 毫米氯化镁2
50 mM DTE，新溶解（Sigma，目录号：D8255）
50 mM CoA （ Neofroxx ，目录号：2100GR005）
100 mM 2-酮戊二酸（Sigma，目录号：75890）
20 mM苄基紫精（Sigma，目录号：D8130）

同位素分析（基于 GC-MS 分析）
玻璃小瓶，1.5 mL（VWR，目录号：548-0018）
用于 GC/MS 小瓶的螺帽（VWR，目录号：548-0814）
玻璃入口，200 µL（VWR，目录号：548-0780）
微量离心管，2 mL（VWR，目录号：525-0228）
玻璃巴斯德移液器，短型（ Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH & Co. KG，目录号：40567001）
超细玻璃棉（ Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH & Co. KG，目录号：41408003）
盐酸，37%（Sigma，目录号：320331）
乙酸，≥99％（Sigma，目录号：A6283）
Dowex 50WX8 200-400（H ± ）（Alfa Aesar，目录号：L13922.18）
甲醇，99.8%（Sigma，目录号：322415）
氨水溶液，25％（Merck，目录号：1054321000）
无水乙腈，99.8%（Sigma，目录号：271004）
N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺≥95％，含有1％叔丁基二甲基氯硅烷（MTBSTFA）（Sigma，目录号：375934），储存于-20℃

设备

厌氧菌培养实验
秤
燃气管道系统
膜真空泵（ Vacuubbrand ，目录号：19137003）
乙烯基厌氧室（Coy 实验室产品）或同等产品
瓶口分配器（品牌，目录号：4600360）或同等产品
pH Meter SevenCompact S210（Mettler Toledo，目录号：30130862）或同等产品
恒温摇床 New Brunswick Innova ® 44R（Eppendorf，目录号：M1282-006）或等效的温控摇床
光学显微镜（蔡司，型号： Axiostar ）或同等产品
Thoma细胞计数室（VWR，目录号：631-0697）

生物质的收获和细胞提取物的制备
Sorvall离心机 RC6+（Thermo Fisher Scientific，目录号：46915）或同等产品
固定角转子 F9-4x1000y（Thermo Fisher Scientific，目录号：096-041032）
台式离心机 5810/5810 R（Eppendorf，目录号：5811000015）或同等产品
转子 A-4-81（Eppendorf，目录号： 5810718007)
台式微量离心机 5417R (Eppendorf)或同等产品
转子 F45-30-11 (Eppendorf)
电动移液器（Eppendorf，型号： Easypet ）或同等产品
乙烯基厌氧室（Coy 实验室产品）或同等产品
光学显微镜（蔡司，型号： Axiostar或同等产品）
超声波均化器 Sonopuls （BANDELIN 电子，目录号：2451）或同等产品
铝制冷却块
-80°C 冰箱

酶测定
Cary 3500 紫外-可见分光光度计（安捷伦）或同等产品；请注意，使用嗜热菌需要一个温度控制的比色皿支架（在我们的例子中是风冷 Peltier 温度控制）
比色皿，400 µ L，光程 10 mm（ Hellma ，目录号：115-10-40）或等效物
注射器 Hamilton，50 µL（Carl Roth，目录号：X048.1）或同等产品
比色皿的橡胶塞
乙烯基厌氧室（Coy 实验室产品）或同等产品
Thermomixer（Eppendorf，型号：comfort）或同等产品
真空泵
超声波浴（BANDELIN electronic，型号：DT 100）或同等产品
超高效液相色谱仪 (UHPLC)（安捷伦，型号：1290 Infinity II LC 系统）或同等学历
反相液相色谱分离柱（相 EC-C18）（Agilent，目录号：699675-902）或同等产品
移液器套件 (RAININ) 或同等产品

同位素分析（基于 GC-MS 分析）
冻干机 Alpha 2-4 LDplus （Martin Christ，Osterode，德国）或同等产品
烤箱（Binder，E28 型，德国图特林根）或同等产品
加热块 Techne ® DRI Block DB 2A（默克，达姆施塔特，德国）或同等产品
GCMS-QP 2010 plus 带自动进样器 AOC20i （Shimadzu，杜伊斯堡，德国）或同等产品
硅胶毛细管柱（Equity TM-5；30 m x 0.25 mm；0.25 µm 薄膜厚度；Sigma-Aldrich， Supelco ，目录号 28098-U）

软件

交互式密码子分析 INCA 软件（ Supek和Vlahovicek ，2005； http: //bioinfo.hr/software-tools/ ）
国家生物技术信息中心(NCBI) BLAST ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ )
（岛津， https: //www.shimadzu.de/labsolutions % E2 % 84 % A2-lcms-software-simple-analytical-platform ）
同位素（Ahmed等人，2014 年， https: //www.uni-wuerzburg.de/tr34/software-developments/isotopo/ ）
微软 Excel（微软，2016， https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel ）

程序

厌氧菌培养实验
请注意，气体的使用是根据我们管道系统的规格描述的。特别是，手动添加 CO 2需要一个无菌注射器（公鲁尔锁）、一个鲁尔到管道连接器（母鲁尔锁），以及专门用于13 CO 2气体的讲瓶控制阀连接到碳钢讲座瓶（参见材料和试剂 A）。
不同CO 2浓度下的生长
mL 总体积；20 mL、5 mL 和 2 mL 培养基）中培养厌氧微生物。
脱硫菌科栽培见配方1）种）。请记住，报告的成分列表可能与适合培养其他自养生物的成分列表不同。
2 （50–100 kPa 过压）执行真空气体循环（通常每次 1 分钟）约 40 分钟（见注 5），使溶液缺氧。
在最终浓度为 0.05% (w/v) 时添加 Na 2 S∙9H 2 O来减少溶液。
将培养基的 pH 值调整到相关生物体的最佳生长状态。事实上，由于硫化钠的添加使介质 pH 值呈碱性（在我们的例子中 pH 值约为 8），因此有必要通过添加缺氧的 HCl 溶液来调节它（见注 5）。如果与生长培养基相容，可以使用其他酸。请考虑不同的培养基成分可能会影响产生的 pH 值，并与我们的经验不同。
除去培养基瓶中的过压，然后将其转移到厌氧室（参见注释 3，了解不使用厌氧室的另一种等分方式）。
在瓶分配器的帮助下对介质（20 mL、5 mL 和 2 mL）进行分装。培养减硫剂时，将元素硫粉（10 g L -1 ）预先分配到血清瓶中。
用丁基橡胶塞封闭血清瓶，然后将它们转移出厌氧室，并用压接铝盖密封。
在 110°C 高压灭菌含硫介质 40 分钟。高压灭菌的培养基可以长期保存在 RT 中。请记住，用于培养其他自养微生物的培养基可能需要不同的灭菌温度。
接种前，将无菌过滤维生素（见配方 3）添加到培养物中并更换气相。由于热敏感性，在灭菌前通常不向培养基中添加维生素。将 40 mL 维生素溶液转移到血清瓶中，使其缺氧（见注 5），然后使用无菌一次性注射器和针头将维生素厌氧添加到培养基中，最终浓度为 10 mL L - 1 。
2执行真空气体循环来替换新鲜培养物的气相。在添加 CO 2之前，释放培养物中存在的任何超压。
添加 CO 2：20 mL 培养物为 80 kPa 或 40 kPa，5 ml 培养物为 10 kPa，5 mL 培养物为 4 kPa，2 mL 培养物为 2 kPa。
填充 H 2至 100 kPa 过压。
如有必要，使用缺氧 1 M 将 pH 值调节至有机体最佳状态 NaOH（见注 5）。这很重要，因为添加 CO 2会使培养基酸化（CO 2 + H 2 O ⇋ H 2 CO 3 ⇋ 〖"HCO" 〗_"3" ^"-" + H + )。
对于接种，在指数后期使用积极生长的培养物，以尽量减少滞后期。在我们的例子中，起始细胞密度为 10 6 [细胞/mL]。在最佳生长温度下搅拌主要培养物（图 1A）。

碳 13 标记实验
1 L 输液瓶（200 mLmedium ）中存在碳 13 化合物的情况下厌氧微生物的培养。
解决成分（见脱硫菌科栽培配方1 ）种）。请记住，报告的成分列表可能与适合培养其他自养微生物的成分列表不同。
在量筒的帮助下分装介质 (200 mL)。培养减硫剂时，将单质硫粉（10 g L -1 ）预先分配到1 L输液瓶中。用橡胶塞和铝盖封闭瓶子。
2 （50-100 kPa 过压）进行真空气体循环（通常每次 1 分钟）约 15-20 分钟（见注 5），使培养物缺氧。
最终浓度为 0.05% (w/v)的 Na 2 S∙9H 2 O来减少培养物。
将培养基的 pH 值调整到相关生物体的最佳生长状态。事实上，由于硫化钠的添加使介质 pH 值呈碱性（在我们的例子中 pH 值约为 8），因此有必要通过添加缺氧的 HCl 溶液来调节它（见注 5）。如果与生长培养基相容，可以使用其他酸。请考虑不同的培养基成分可能会影响产生的 pH 值，并与我们的经验不同。
在 110°C 高压灭菌含硫介质 40 分钟。高压灭菌的培养基可以长期保存在 RT 中。请记住，用于培养其他自养微生物的培养基可能需要不同的灭菌温度。
接种前，将无菌过滤维生素（参见程序 A1j）添加到培养物中。
根据以下说明添加示踪剂（i： 13 CO 2，或 ii：[1- 13 C]谷氨酸）。
13 CO 2 :
2执行真空气体循环来替换新鲜培养物的气相。在添加13 CO 2之前，释放培养物中存在的任何超压。用注射器手动添加13 CO 2 (99% 碳 13) 至 40 kPa 的最终分压，并用 H 2填充至 100 kPa 超压。
[1- 13 C]谷氨酸：
将气相替换为 H 2 :CO 2 (80:20; carbon-12) 并将 [1- 13 C]谷氨酸盐添加到培养基中，最终浓度为 14 mg L -1 。
如有必要，使用缺氧 1 M 将 pH 值调节至有机体最佳状态 NaOH（见注 5）。这很重要，因为添加 CO 2会使培养基酸化（CO 2 + H 2 O ⇋ H 2 CO 3 ⇋ 〖"HCO" 〗_"3" ^"-" + H + )。
对于接种，在指数后期使用积极生长的培养物，以尽量减少滞后期。请注意，在我们的案例中，起始细胞密度为 10 6 [细胞/mL]。在最佳生长温度下搅拌主要培养物（图 1B）。

图1。在孵化器摇床中进行厌氧培养。
A.装有 20 mL 培养基的血清瓶。 B.装有 200 mL 培养基的输液瓶。两种培养物都含有元素硫的悬浮液。

生物质的收获和细胞提取物的制备
在中期指数生长期间收获细胞以进行酶活性测量，并在后期指数生长期间收获细胞以进行 GC-MS 分析。识别在指数生长期后期，我们使用Thoma细胞计数室（见注释 7 和数据分析 A2）对培养基中的细胞进行计数，并将结果与相应生物体测量的生长曲线进行比较。在我们的案例中，文化通常达到生长 48-96 小时后的指数后期生长阶段。
离心前分离元素硫和细胞，释放超压，打开瓶子，在好氧条件下用折叠过滤器和漏斗过滤培养基。请注意，最好在通风橱下执行此程序，尤其是在硫还原剂产生 H 2 S 作为代谢副产物的情况下。
将过滤后的培养物离心（15,000 × g ，4°C，20 分钟）并小心弃去上清液。请注意，某些生物的细胞沉淀可能很容易重新悬浮。为了获得更好的结果，可以使用电子移液器在此过程中丢弃上清液。
用大约 20 mL 的剩余培养基重新悬浮细胞颗粒，并将细胞悬浮液转移到 50 mL 离心管中。
离心细胞悬液（3,000 × g ，4°C，40 分钟）并小心弃去上清液。
用 1 mL 的 0.9% [w/v] NaCl 溶液（盐水）重新悬浮细胞颗粒，并将细胞悬浮液转移到 2 mL 微量离心管中。
离心细胞悬液（ 21,000 × g ，4°C，20 分钟）并小心弃去上清液。
用液氮冷冻细胞沉淀并将其储存在 -80°C，或破坏细胞以进行进一步测试。
在后一种情况下，将带有细胞颗粒的微量离心管转移到厌氧室。
用 500 μL 的缺氧细胞裂解缓冲液重新悬浮细胞颗粒（参见配方 5）。用冷却的铝块保持溶液冷却。
用超声波均质器裂解细胞（60% 振幅，4 分钟运行，1-s 脉冲，2-s 中断；总能量输入为 2，000 kJ）。特别是对于氧敏感酶（即丙酮酸合酶和2-酮戊二酸合酶），在厌氧室或厌氧环境中进行缺氧打开细胞是至关重要的。
, 000 × g , 4°C, 20 分钟)去除不溶性细胞碎片。
确定蛋白质浓度 (Bradford, 1976)，然后在冰上处理。细胞提取物适合大约 3 – 4 小时的工作。在-20 °C 下长期储存会损害酶的稳定性。

酶测定
在以下程序中，给出了反应组分的最终浓度。建议的储备浓度列在材料和试剂部分 C。在进行检测之前，请考虑以下实用建议：开始与底物的酶促反应；根据相关生物的最佳生长温度选择测试温度，并假设温度升高 10°C，反应速率加倍；高温可能会损害反应混合物中存在的化学物质的稳定性；在分光光度测量的情况下，请注意所使用设备的最大吸光度限制。
测试至少两种不同浓度的细胞提取物以获得活性对添加酶量的线性依赖性。对于 roTCA 循环的高活性酶（即柠檬酸合酶和苹果酸脱氢酶）的测量，如果研究的生物体具有该循环，则只需将少量细胞提取物添加到反应混合物中。在我们的例子中，0.5 – 1 (µg protein∙mL -1 ) 的细胞提取物足以获得线性活性。这对应于在柠檬酸合成方向（草酰乙酸 + 乙酰辅酶 A + H 2 O →柠檬酸 + CoA）或苹果酸方向上的柠檬酸合酶测定中每分钟吸收 0.3 到 0.7 个单位的差异 ( Δabs ∙min -1 )草酰乙酸还原方向的脱氢酶（草酰乙酸 + NADH + H + →苹果酸 + NAD + )。然而，柠檬酸合酶在柠檬酸裂解方向上的活性要低得多（柠檬酸 + 辅酶 A →乙酰辅酶 A + 草酰乙酸 + H 2 O），因此需要混合物中的高蛋白质浓度（在我们的例子中，至少高出 20 倍） .如果化验结果不明确，则可以通过用水代替细胞提取物或底物来进行额外的阴性对照。
在我们的例子中，反应混合物的最终体积为 300 µL。
柠檬酸合酶（正向反应，分光光度连续测定，λ=412 nm）
在由以下组成的反应混合物中测量柠檬酸合酶的活性：
100 mM Tris-HCl (pH 7.5)
1 毫米 DTNB
0.5 mM 乙酰辅酶A
5 mM 草酰乙酸
细胞提取物
dH 2 O
将分光光度计的比色皿架预热到测试温度。
将除草酰乙酸以外的所有反应混合物组分添加到比色杯中，以达到 300 μL的最终体积。
用移液器彻底混合反应混合物。
开始测量并获得稳定的基线。
随着基线稳定，等待 1 分钟以记录背景活动，然后通过添加 5 mM 草酰乙酸开始反应。使用 DTNB (ε 412 =14.2 mM -1 cm -1 [Riddles et al ., 1979]) 作为试剂，监测乙酰辅酶 A 中游离 CoA 的草酰乙酸依赖性形成。
柠檬酸合酶（逆向反应，分光光度连续测定，λ=365 nm）
在由以下组成的反应混合物中测量逆向反应中柠檬酸合酶的活性：
1) 100 mM Tris-HCl (pH 7.5)
2) 5 毫米 DTE
3) 5 毫米氯化镁2
4) 0.5 毫米辅酶A
5) 0.5 毫米 NADH
6) 20 毫米柠檬酸盐
7) 20 U/mL 猪苹果酸脱氢酶
8)细胞提取物
9) dH 2 O
将分光光度计的比色皿架预热到测试温度。
将除柠檬酸盐外的所有反应混合物组分添加到比色杯中，以达到 300 μL的最终体积。
用移液器彻底混合反应混合物。
开始测量并获得稳定的基线。
随着基线稳定，等待 1 分钟以记录背景活动，然后通过添加 20 mM 柠檬酸盐开始反应。由于辅助酶苹果酸脱氢酶的活性，在柠檬酸合酶逆向反应中形成草酰乙酸，监测 NADH 的柠檬酸依赖性氧化（ε 365 =3.4 mM -1 cm -1 [ Bergmeyer ，1975]）。
柠檬酸合酶（逆向反应，UHPLC 不连续测定，λ=260 nm）
进行化验
在由以下组成的反应混合物中测量逆向反应中柠檬酸合酶的活性：
1) 100 mM Tris-HCl (pH 7.5)
2) 5 毫米 DTE
3) 5 毫米氯化镁2
4) 0.5 毫米辅酶A
5) 0.5 毫米 NADH
6) 20 毫米柠檬酸盐
7) 20 U/mL 猪苹果酸脱氢酶
8)细胞提取物
9) dH 2 O
将 1.5 mL 微量离心管的热混合器预热至测试温度。
在这种情况下，混合除柠檬酸盐以外的所有反应混合物组分。最终体积应确保四个时间点的正确采样（例如，最终体积为100 μL 四个 20 μL样品）。
彻底混合反应混合物并旋转下来。
在测试温度下将反应混合物预孵育 1 分钟，然后用 20 mM 柠檬酸盐开始反应。
取适量（t0）并立即停止反应（样品：停止溶液，1:1 [v/v]）。
同样，在1 分钟 (t1)、2 分钟 (t2) 和 10 分钟 (t10) 后取样，每次立即停止反应（样品：停止溶液，1:1 [v/v]）。
在测定过程中，保持样品冷却，然后用液氮冷冻并储存在-20°C。
UHPLC 运行
将样品离心两次（ 21,000 × g ，4°C，5 分钟）以去除不溶性蛋白质和颗粒。
在 2 mL 螺旋盖小瓶或 96 孔微孔板中准备 UHPLC 样品。如有必要，仅使用 UHPLC 级 ddH 2 O稀释样品。
在我们的案例中，CoA 酯使用配备 EC-C18 色谱柱的 1290 Infinity II UHPLC 系统进行反相 LC 分离（Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 1.9 µm 2.1 × 50 mm）。二极管阵列检测器（Agilent，灯目录号：G7117B）允许在 260 nm 处对 CoA 和不同 CoA-酯进行 UV 检测。
运行前，用 UHPLC 级 ddH 2 O 和磷酸钾缓冲液清洗泵，并将色谱柱平衡至起始条件（2% 乙腈 - 98% 磷酸钾缓冲液）。
对于实际的样品分析，使用以下色谱溶剂：溶剂 A、乙腈和溶剂 B、磷酸钾水溶液（pH 7）（参见配方 7）。使用梯度洗脱进行色谱：注射后，在 2.66 分钟内将乙腈的浓度从 2% 增加到 8%，在 3.33 分钟内增加到 30%，然后在 3.68 分钟内将其降低到 2%，并保持等度直至 5.00 分钟.保持流速恒定在 0.55 m L min -1 。
ATP-柠檬酸裂解酶（分光光度连续测定，λ=365 nm）
在由以下组成的反应混合物中测量 ATP-柠檬酸裂解酶的活性：
1) 100 mM Tris-HCl (pH 7.5)
2) 5 毫米氯化镁2
3) 5 毫米 DTE
4) 0.5 毫米辅酶A
5) 0.4 毫米 NADH
6) 20 毫米柠檬酸盐
7) 0.5 毫米三磷酸腺苷
8) 20 U/mL 猪苹果酸脱氢酶
9) 细胞提取物
10) dH 2 O
将分光光度计的比色皿架预热到测试温度。
将除 ATP 之外的所有反应混合物组分添加到比色皿中，以达到 300 μL的最终体积。
用移液器彻底混合反应混合物。
开始测量并获得稳定的基线。
随着基线稳定，等待 1 分钟以记录背景活动，然后通过添加 0.5 mM ATP 开始反应。由于混合物中存在的帮助酶苹果酸脱氢酶的活性，通过监测 NADH 氧化 (ε 365 =3.4 mM -1 cm -1 [ Bergmeyer , 1975]) 来测量草酰乙酸的形成。
柠檬酸裂解酶（分光光度连续测定，λ=365 nm）
在由以下组成的反应混合物中测量柠檬酸裂合酶的活性：
1) 100 mM Tris-HCl (pH 7.5)
2) 5 毫米 DTE
3) 5 毫米氯化镁2
4) 0.5 毫米 NADH
5) 20 毫米柠檬酸盐
6) 20 U/mL 猪苹果酸脱氢酶
7) 细胞提取物
8) dH 2 O
将分光光度计的比色皿架预热到测试温度。
将除柠檬酸盐外的所有反应混合物组分添加到比色皿中，以达到 300 μL的最终体积。
开始测量并获得稳定的基线。
随着基线稳定，等待 1 分钟以记录背景活动，然后通过添加 20 mM 柠檬酸盐开始反应。由于混合物中存在的帮助酶苹果酸脱氢酶的活性，测量草酰乙酸形成监测 NADH 氧化（ε 365 =3.4 mM -1 cm -1 [ Bergmeyer ，1975]）。
苹果酸脱氢酶（分光光度连续测定，λ=365 nm）
在由以下组成的反应混合物中测量苹果酸脱氢酶的活性：
1) 100 mM Tris-HCl (pH 8)
2) 5 毫米 DTE
3) 5 毫米氯化镁2
4) 0.5 NADH
5) 2.5 mM 草酰乙酸
6) 细胞提取物
7) dH 2 O
将分光光度计的比色皿架预热到测试温度。
将除草酰乙酸以外的所有反应混合物组分添加到比色皿中，以达到 300 μL的最终体积。
用移液器彻底混合反应混合物。
开始测量并获得稳定的基线。
随着基线稳定，等待 1 分钟以记录背景活动，然后通过添加 2.5 mM 草酰乙酸开始反应。测量 NADH 的氧化（ε 365 =3.4 mM -1 cm -1 [ Bergmeyer ，1975]）。
丙酮酸合酶（分光光度厌氧连续测定，λ=578 nm）
丙酮酸合酶反应需要还原条件。添加连二亚硫酸盐以减少紫精，直到溶液略呈蓝色（578 nm 处的吸光度约为 0.8），然后继续。有一种替代方法可以在不使用厌氧帐篷的情况下进行该测试（见注 6）。
在由以下组成的反应混合物中测量丙酮酸合酶的活性：
1) 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)
2) 5 毫米氯化镁2
3) 2.5 毫米 DTE
4) 0.5 毫米辅酶A
5) 1 mM 甲基紫精
6) 10 mM 丙酮酸
7) 细胞提取物
8) dH 2 O
将分光光度计的比色皿架预热到测试温度。
在厌氧帐篷中工作时，将除丙酮酸外的所有缺氧反应混合物组分添加到比色皿中，以达到 300 μL的最终体积。
用移液器彻底混合反应混合物。
用橡胶塞关闭比色皿，然后将其移出帐篷。
2替换比色皿的气相。
开始测量并获得稳定的基线。
随着基线稳定，等待 1 分钟以记录背景活动，然后使用Hamilton 注射器添加 10 mM 丙酮酸开始反应。监测甲基紫精的丙酮酸依赖性还原（ε 578 nm=9.7 mM -1 cm -1 [Dawson et al ., 1986]）。
2-氧代戊二酸合酶（分光光度厌氧连续测定，λ=578 nm）
2-氧代戊二酸合酶反应需要还原条件。添加连二亚硫酸盐以减少紫精，直到溶液略呈蓝色（578 nm 处的吸光度约为 0.8），然后继续。请注意，有另一种方法可以在不使用厌氧帐篷的情况下进行该测试（见注 6）。
在由以下组成的反应混合物中测量 2-氧代戊二酸合酶的活性：
1) 100 mM Tris-HCl (pH 7.5)
2) 5 毫米氯化镁2
3) 2.5 毫米 DTE
4) 0.5 毫米辅酶A
5) 1 mM 苄基紫精
6)10 mM 2-酮戊二酸
7) 细胞提取物
8) dH 2 O
将分光光度计的比色皿架预热到测试温度。
在厌氧帐篷中工作时，将除 2-酮戊二酸以外的所有缺氧反应混合物成分添加到比色皿中，以达到 300 μL的最终体积。
用移液器彻底混合反应混合物。
用橡胶塞关闭玻璃比色皿，然后将其移出帐篷。
2替换比色皿的气相。
开始测量并获得稳定的基线。
随着基线稳定，等待 1 分钟以记录背景活动，然后通过添加 10 mM 2-oxoglutarate 开始反应。监测苄基紫精的 2-氧代戊二酸依赖性还原（ε 578 nm=9.7 mM -1 cm -1 [Dawson et al ., 1986]）。

同位素分析（基于 GC-MS 分析）
使用冷冻干燥机冻干细菌细胞颗粒。为确保干燥，通常将样品干燥过夜。
将 2 mg 干燥样品转移到 1.5 mL 玻璃瓶中。
加入 500 µL 的 6 M HCl（水溶液）并在 105°C 下孵育样品 15 小时，以对细胞蛋白进行酸性水解。
在 70°C 的加热块中，在氮气流下干燥样品约 45 分钟。
将 200 μL 的 50% 乙酸（水溶液）添加到干燥的残留物中，并通过剧烈涡旋小瓶 10 秒来重新溶解样品。
准备用于氨基酸分离的阳离子交换柱。
用玻璃棉填充 1 mL 移液器尖端的下五分之一。
在玻璃棉上添加 200 μL 的 Dowex。
用 1 mL 的 70% MeOH（水）和 1 mL 的 ddH 2 O洗脱柱。
在柱下方放置一个 2 mL 微量离心管以收集水相。
使用 150 mm 巴斯德吸管小心地将样品加入色谱柱，不要淘洗色谱柱材料。
样品渗入色谱柱后，将 800 µL H 2 O 填充到初始样品瓶中，并使用步骤 8 中的巴斯德移液器将这部分水添加到色谱柱中。
添加另一个 800 μL 的 ddH 2 O 之后，首先应用的量（步骤 9）已经渗透到列中。
在整个水性洗脱液从色谱柱中渗出后，在其下方放置一个 1.5 mL 玻璃小瓶以收集碱性洗脱液。
将 1 mL 的 4 M 氨溶液（水溶液）涂在色谱柱上。
在 70°C 的加热块中，在氮气流下干燥碱性洗脱液约 50 分钟。
对于氨基酸的衍生化，在干燥的碱性残渣中加入 50 μL 的无水乙腈和 50 μL 的 MTBSTFA。
将混合物在加热块中于 70°C 孵育 30 分钟，然后将其转移至 200 µL 玻璃入口。
对于 GC/MS 测量，在接口温度为 260°C 的进样器中以分流模式 (1:5) 注入等分试样 (0.1 – 5 µL)。
将色谱柱保持在 150°C 3 分钟，然后以 7°C/分钟的梯度将温度升高到最终的 280°C。再保持此温度 3 分钟。
使用选定的离子监测 (SIM) 测量样品一式三份。对于每个片段（质量 M，仅包含12 C），测量从 M-1 到 M+X+4 的离子迹线的强度，其中 X 是相应片段中的碳数。
使用Labsolutions集成各个信号。
等人的说法，通过与未标记的样品进行比较，计算出总的13 C 过量以及每个片段中的同位素组成。（2014）。
13 C 过量或标记分子的百分比可以用柱形图表示，而同位素体组成理想情况下使用 Excel 2016 显示为堆叠的 100% 列。

数据分析

不同CO 2浓度增长实验
每个测试的 CO 2浓度至少使用三个重复培养物进行生长实验，并将结果显示为平均值 ± SEM
从接种开始，每 24 小时计数一次细胞，直到培养物达到静止期。请记住，其他物种的世代时间可能不同；因此，应选择其他细胞计数间隔。
在使用 roTCA 循环的生物体的情况下，生长应强烈依赖于 CO 2浓度。在我们的案例中，测试的脱硫菌科显示出大约 1.5 – 2 倍的延长世代时间 { gt = (t 2 -t 1 ) /( 3.3*lg [细胞密度2 /细胞密度1 )]}，CO 2从 40% 下降到 5%。在这些 CO 2浓度下， H. maritima的生成时间分别为 17 和 30 小时， D. acetivorans 8 和 13.5 小时， D. propionica 9 和 18 小时，以及D. multipotens 10 和 13.5 小时（Steffens等等人，2021 年）。
根据 CO 2分压，最终的细胞密度也应表现出类似的依赖性，最终在 2% 和 1% CO 2的情况下达到中等或不可检测的增长。

酶测定
对中枢代谢酶的活性测定进行至少两次生物重复，并为每个生物重复进行至少三个技术复制。技术复制不应是相同的测定，而是反应对反应混合物中存在的酶量的依赖性的证明。为此，请测试不同浓度的细胞提取物。所得的测量结果应显示更高的活性率 [ΔAbs∙min -1 ] 随着酶浓度的增加而增加，但保持大致相同的比活性 [µmol∙min -1 ∙mg -1蛋白质]。
酶的比活性通常报告为反应混合物中每毫克蛋白质每分钟转化的μmol底物（即，比活性 [µmol∙min -1 ∙mg -1蛋白质]）。
在分光酶测定的情况下，使用 Lambert-Beer 定律计算活性：c = A∙ε -1 ∙d -1 ，其中 ε 是摩尔消光系数 [M -1 ∙cm -1 ]，d 是光程长度 [cm]，c 是衰减物质的浓度，通常是消耗的底物或形成的产物。
首先，确定每分钟的吸光度变化 [ΔA∙min -1 ]。
将吸光度变化除以相应的消光系数和光程长度（通常为 1 cm），得到每分钟的浓度变化 [M∙min -1 ]。重新计算毫摩尔浓度（即除以 1,000），这相当于 [µmol∙ml -1 ∙min -1 ] 中的酶活性。
乘以被测酶制剂/细胞提取物的稀释倍数（例如，5% [v/v] 细胞提取物的测试代表稀释倍数为 20）。如果酶溶液被稀释，也要考虑这种稀释。
最后，通过将反应混合物 [µmol∙mL -1 ∙min -1 ]中获得的总活性除以蛋白质浓度 [mg 蛋白质∙mL -来计算 [µmol∙min -1 ∙mg -1蛋白质] 中的比活性1 ]，由 Bradford 方法确定（参见程序 B13）。
在柠檬酸盐裂解不连续测定（UHPLC；柠檬酸盐 + CoA → 乙酰-CoA + 草酰乙酸 + H 2 O）的情况下，峰与乙酰-CoA 和 CoA 标准的保留时间相关（图 2A 和 2B）。这两种物质在 260 nm 处的光谱可用于区分游离 CoA 和 CoA 硫酯（图 2C）。
和乙酰辅酶 A 峰的积分面积来计算比活性。由于 CoA 和乙酰-CoA 具有大致相同的消光系数（分别为 16.3 和 16.4 mM -1 cm -1 ），因此可以将初始 CoA 浓度乘以形成的乙酰-CoA 的相对丰度 [%]，得到在相应的时间点获得其在反应混合物中的浓度。
一旦计算出乙酰辅酶 A的浓度 [µmol∙mL -1 ]，将其除以反应停止的分钟 [min -1 ]。
将总活性乘以稀释因子 [µmol∙mL -1 ∙min -1 ]。如果酶溶液被稀释d，也要考虑这种稀释。
为了最终获得比活性 [µmol∙min -1 ∙mg -1蛋白质]，将总活性除以酶浓度 [mg∙ml -1 ]，由 Bradford 方法确定（参见程序 B13）。
对于使用 roTCA 循环的生物体，预计柠檬酸合酶和苹果酸脱氢酶活性 >10 [µmol∙min -1 ∙mg -1蛋白质]。

图 2。柠檬酸合酶进行的柠檬酸裂解反应（折扣试验）。
A.报告了两种标准品（游离 CoA 和乙酰-CoA）的 UHPLC 色谱图以及相应的保留时间（分别为 0.864 和 1.617 分钟）。 B.两个时间点的 UHPLC 色谱图：在反应开始 (0 分钟) (柠檬酸盐 + CoA →乙酰-CoA + 草酰乙酸 + H 2 O) 时立即取样，加入自养生长H的细胞提取物. maritima， 10 分钟后。 C.标准品（红色）和样品（蓝色）在 260 nm 处乙酰辅酶 A 和辅酶 A 峰的吸收光谱比较。

同位素分析（基于 GC-MS 分析）
检查图 3 以概述为跟踪 roTCA 循环活动而执行的标记实验的分析。天冬氨酸和谷氨酸可替代直接 roTCA 循环中间体草酰乙酸和 2-氧代戊二酸。
在使用13 CO 2作为示踪剂的实验中（图 3A），分析天冬氨酸和谷氨酸的同位素组成可以直接了解 roTCA 循环活动；虽然只有循环的选定部分结合了13 CO 2时，也可能产生较轻的同位素体（在查看以 [1- 13 C]谷氨酸作为示踪剂的实验时（图 3B），比较标记分子在天冬氨酸和谷氨酸的不同片段中的百分比用作 roTCA 循环活性的读数。在活跃的 roTCA 循环的情况下，标记从谷氨酸的 C1 转移到天冬氨酸的 C4。随后，含有 C1-4 或 C2-4 的天冬氨酸片段显示相同百分比的标记分子。通过 roTCA 循环的进一步传播在谷氨酸的 C2 或 C5 位置诱导标记，最初仅在 C1 位置标记。

图 3。分析标记实验以跟踪 roTCA 循环活动。
A.分别在三轮和四轮 roTCA 循环后将13 CO 2结合到天冬氨酸和谷氨酸中，产生不同的同位素体。直方图显示了检测到的同位素体的相对丰度。根据直方图的图例，标记的碳示意性地表示为彩色圆圈。 B. [1- 13 C]谷氨酸通过 roTCA 循环后，比较标记分子在谷氨酸（蓝色：C1-5；绿色：C2-5）和天冬氨酸（蓝色：C1-4）的不同片段中的百分比；绿色：C2-4)。化学结构中的彩色条表示相应片段中分子的部分。 AcCoA ：乙酰辅酶A； Pyr ：丙酮酸； OAA：草酰乙酸； Asp：天冬氨酸； Succ ：琥珀酸盐； 2-OG：2-酮戊二酸； Glu：谷氨酸；柠檬酸盐：柠檬酸盐。数据是至少三个生物学重复的平均值±SEM。

笔记

使用其他 CO 2固定途径的自养生物在生长实验中可能不会表现出相同的浓度依赖性。因此，它们可能被排除在进一步分析之外。例如，如前所述，脱硫杆菌使用该循环（ rTCA循环）的 ATP-柠檬酸裂合酶变体的嗜氢杆菌在所有测试的生长条件下同样生长良好。对于其他自养生物，没有系统地研究使用rTCA循环的细菌的 CO 2浓度的生长独立性。
请注意，在实际无菌过滤之前，过滤器（无菌注射器过滤器；膜过滤器）应使用 20 mL 0.9% [w/v] NaCl 溶液（盐水）和 20 mL ddH 2 O 进行洗涤步骤，以去除任何过滤材料中可能存在的污染物（例如甘油）。
通过使用一次性注射器和针头将培养基从缺氧培养基转移到厌氧血清瓶，可以在不使用厌氧帐篷的情况下分装培养基。
培养物变成粉红色（刃天青氧化）通常表明存在氧气污染或强烈的 pH 变化。 Resofurin是导致粉红色着色的反应中间化合物，通常具有细胞毒性，并且变成粉红色的培养物可能已经死亡。
在我们的例子中，术语缺氧表示不含分子氧的溶液。要使溶液缺氧，请在搅拌下应用真空氮气循环（每次1-3 分钟，取决于体积）。作为一般规则，每升溶液40 – 45 分钟是此过程所需的最短时间。随后添加还原剂（在本协议中，仅在培养基的情况下）确保溶液完全不含分子氧。
执行这些厌氧酶测定不一定需要厌氧手套箱。可以有氧混合反应混合物的所有组分，用橡胶塞封闭比色皿，然后用 N 2冲洗气体空间。在用连二亚硫酸盐还原紫精直到溶液略带蓝色（在 578 nm 处吸光度约为 0.8）后，加入细胞提取物并继续。或者，也可以使每个溶液组分缺氧，如注释 5 所述，并在比色杯中厌氧混合，通过冲洗 N 2 （约 1 分钟）使其缺氧。然而，他的方法很难用于低活性酶的测量，因为在塞子中溶解的氧气可能会影响这种测定。
可以使用Thoma计数室计算培养物的细胞密度（细胞/mL）。它通常有两个计数区域，位于定义的深度（0.1 毫米），由 16 个大正方形组成，以三条平行线为界。每个大方格由16个小方格（0.0025 mm 2 ）组成，用于实际计数。
在样品应用之前，将盖玻片放在干净的Thoma室上，在外杆上施加温和的压力，直到形成牛顿环。如有必要，稀释样品，然后用移液器在计数区域附近缓慢加载。水的表面张力将有助于正确加载样品。找到带有 PH1 10 ×物镜的计数区域，然后移动到 PH2 40 ×物镜。请记住，腔室太厚而不能与浸油一起使用。每次使用后，必须用 70% [v/v] EtOH 彻底清洁腔室。
从左上角的小方块开始计数，然后以蛇形图案向右进行。计算位于小正方形内和相邻两侧（左上或右下）的单元格。分裂细胞计为两个。要发现位于不同平面上的所有单元格，请更改焦点（失焦-锐利-失焦）。数四个大方块；单个大方块计数之间的最终差异不应高于 10 个细胞/方块。
确定细胞计数的平均值并计算细胞密度（细胞/mL）。计数室的实际容积为 0.004 mm 3 ，等于 0.004 μL （0.1 mm ∙ 0.0025 mm 2 ∙ 16 个小方块）。最后，将体积乘以 250，得到细胞/ μL ，然后乘以 1,000，得到细胞/ mL。
细胞/mL=平均细胞数∙稀释倍数∙ 2.5*10 5

食谱

海豌豆_ _ acetivorans 、 D. multipotens和D. propionica培养基
将列出的成分（硫和维生素除外）溶解在 700 mL 的 dH 2 O 中，然后加至 1 L。
H. maritima的成分列表（由DSMZ 培养基 854改良，pH 5.5 – 6.0）：
0.33 g L -1 NH 4 Cl
0.33 g L -1 CaCl 2 · 2H 2 O
0.33 g L 1 MgCl 2 · 6H 2 O
0.33 克·升-1氯化钾
0.33 g L -1 KH 2 PO 4
25 克升-1氯化钠
3 g L -1 MOPS 缓冲液
200 mg L -1酵母提取物
1 mg L -1刃天青
10 g L -1硫磺粉
10 ml L -1微量元素溶液（DSMZ 141）
10 ml L -1 Wolfe's 维生素溶液
D. acetivorans (pH 6.5 – 7.0)、 D . multipotens ( pH 6.8) 和D. propionica (pH 6.9 – 7.2)的成分列表（从 DSMZ 480 修改）：
0.33 g L -1 NH 4 Cl
0.33 g L -1 CaCl 2 · 2H 2 O
0.33 g L -1 MgCl 2 · 6H 2 O
0.33 克·升-1氯化钾
0.33 g L -1 KH 2 PO 4
3 克 L -1拖把
10 g L -1硫磺粉
1 mg L -1刃天青
1 mL L -1 SL-10 微量元素溶液
10 mL L -1 Wolfe's 维生素溶液
SL-10微量元素溶液
将成分溶解在dH 2 O中。
3 g L -1 FeCl 2 · 4H 2 O
70 mg L -1 ZnCl 2
100 mg L -1 MnCl 2 · 4H 2 O
4 mg L -1 CuCl 2 · 2H 2 O
24 mg L -1 NiCl 2 · 6H 2 O
36 mg L -1 NaMoO 4 · 2H 2 O
30 毫克 L -1 H 3 BO 3
224 mg L -1 CoCl 2 · 6H 2 O
填充高达 1,000 mL dH 2 O。
无菌过滤器（见注 2）并在 4°C 下储存。
沃尔夫维生素溶液 (DSMZ 141)
将成分溶解在dH 2 O中。
2 mg L -1生物素
2 mg L -1叶酸
10 mg L -1吡哆醇-HCl
5 mg L -1硫胺素-HCl
5 mg L -1核黄素
5 mg L -1烟酸
5 mg L -1 D-Ca-泛酸盐
0.1 mg L -1氰钴胺素
5 mg L -1对氨基苯甲酸
5 mg L -1硫辛酸
填充高达 1,000 mL dH 2 O。
无菌过滤器（见注 2）并储存在 4°C。
微量元素溶液 ( DSMZ 141)
首先，将 1.5 克次氮基三乙酸 (NTA) 溶解在 200 mL 的蒸馏水中。
用 KOH 将 pH 值调节至 6.5，然后溶解以下矿物盐：
3 g L -1 MgSO 4 ·7H 2 O
0.5 g L -1 MnSO 4 ·H 2 O
1 g L -1 NaCl
0.1 g L -1 FeSO 4 ·7H 2 O
0.18 g L 1 CoSO 4 ·7H 2 O
0.1 g L -1 CaCl 2 ·2H 2 O
0.18 g L -1 ZnSO 4 ·7H 2 O
0.01 g L -1 CuSO 4 ·5H 2 O
0.02 g L -1 KAl(SO 4 ) 2 ·12H 2 O
0.01 g L -1 H 3 BO 3
0.01 g L -1 Na 2 MoO 4 ·2H 2 O
0.03 g L -1 NiCl 2 ∙6H 2 O
0.3 mg L -1 Na 2 SeO 3 ·5H 2 O
0.4 mg L -1 Na 2 WO 4 ·2H 2 O
最后，用 KOH 将 pH 值重新调整至 7.0，并填充至 1,000 mL dH 2 O。
无菌过滤器（见注 2）并储存在 4°C。
细胞裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.8，5 mM DTE）
称重 242 mg Tris-HCl 和 77 mg DTE，并将它们溶解在 70 mL dH 2 O中。
例如，所讨论的生物体的最佳生长温度）下将 pH 值调整到 7.8 。
填充高达 100 mL 的 dH 2 O。
2 100%（50–100 kPa 过压；见注 5）执行真空气体循环 15 分钟，使溶液缺氧。
终止溶液（10% 乙腈，1 M HCl）
2 O中小心混合 2 mL 的乙腈 (99.8%) 和 2 mL 的 10 M HCl 。
存储在 RT。
磷酸钾缓冲液（10 mM KH 2 PO 4 /K 2 HPO 4 ，pH 7.0）和 UHPLC 级水
在 500 mL 的 ddH 2 O 中溶解0.34 g KH 2 PO 4和 0.57 g K 2 HPO 4以达到 10 mM 磷酸盐缓冲液的最终浓度。
过滤 500 mL 的 ddH 2 O，然后过滤 500 mL 的磷酸钾缓冲液（0.22 μm 膜过滤器）。
用超声波浴或真空泵将溶液脱气 5 分钟。
每次运行前准备新鲜的 UHPLC 级溶液。

致谢

为由 Deutsche Forschungsgemeinschaft （DFG，德国研究基金会）Project-ID BE 4822/5-1 to IAB 和 Project-ID 364653263–TRR 235 to WE资助的先前发表的工作（Steffens等人，2021 年）开发的和 TS 以及 Hans-Fischer Gesellschaft（慕尼黑）到 WE

利益争夺

作者没有利益冲突或竞争利益。

参考

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