材料和试剂

移液器吸头（Rainin，梅特勒-托利多，美国）
提示 GP-LTS-A-1,000 µl-768/8（Rainin，目录号：17014338）
提示 GP-LTS-A-250 µl-/F-960/10（Rainin，目录号：30389288）
GP-LTS-A-10 µl-960/10（Rainin，目录号：30389284）
Eppendorf 聚丙烯 DNA LoBind 管（2.0 毫升）（Thermo Fisher Scientific，目录号：10051232）
WebSeal 96 孔板，圆孔，条形码（Thermo Fisher Scientific，目录号：601 80-P206B）
康宁® 96孔聚丙烯深孔板（Sigma-Aldrich公司，目录号：CLS3957）
Corning ® 96 圆孔微孔板存储垫 III（Sigma-Aldrich，目录号：CLS3080）
Zone-Free TM密封膜（Sigma-Aldrich，目录号：Z721646）
玻璃器皿购自 DURAN (DWK Life Sciences, Wertheim, Germany)
使用的细菌种类：Clostridium saccharolyticum ；类型菌株，WM1；税号：610130；内部数据库 ID：NT5037。[储存：mGAM 培养基中的 20% 甘油，-80°C 储存]
Optima ® LC-MS 级乙腈（Fisher Chemical，目录号：A955-212）
甲醇（Fisher Chemical，目录号：A456-212）
水（Fisher Chemical，目录号：W6-121）
LC-MS LiChropur ®级甲酸（Merck KGaA，目录号：5330020050）
度洛西汀标准品（Sigma-Aldrich，Merck KGaA，目录号：SML0474）
内标盐酸氟西汀（Sigma-Aldrich，Merck KGaA，目录号：F132）
磺胺二甲嘧啶（Sigma-Aldrich，Merck KGaA，目录号：S5637）
磺胺二甲嘧啶（Sigma-Aldrich，Merck KGaA，目录号：S5632）
Pierce TM三重四极杆校准溶液，扩展质量（Thermo Fisher，目录号：88340）
mGAM 培养基：岐阜厌氧培养基肉汤，改良（HyServe，目录号：05433）
GMM（肠道微生物群培养基）
DMSO溶剂
萃取溶剂（见配方）
1 µM 度洛西汀储备溶液制备（见配方）
1 µM 氟西汀储备溶液制备（见配方）
流动相缓冲液制备（见配方）

设备

移液器（Eppendorf AG，汉堡，德国）
Eppendorf Multipette ® M4（Eppendorf，目录号：4982000012）
Eppendorf Research plus 移液器 (100-1,000 µl)
多通道 8 通道，30-300 µl（Eppendorf，目录号：3122000051）
多通道 8 通道，0.5-10 µl（Eppendorf，目录号：3122000019）
Vanquish UHPLC-MS/MS 系统与 Q-Exactive plus HRMS（Thermo Scientific，MA，USA；目录号：IQLAAAAGABHFAPUMZZZ）耦合
ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱（100Å，1.8 µm；2.1 × 100 mm）（Waters，目录号：186003539）
S系列加热超声波清洗水浴（Fisherbrand TM ，目录号：10162372）
用于涡旋的 Eppendorf MixMate （Eppendorf，目录号：5353000510）或同等产品
Hamilton TM 1700 Series Gastight TM Syringe 500 μl（Thermo Fisher Scientific，目录号：365JLT41）
离心机 5418 R，冷藏（Eppendorf，目录号：5401000013）
乙烯基厌氧室 C 型（Coy Laboratory Products, Inc.，美国）
水浴超声波仪；Fisherbrand TM S 系列加热超声波清洁器（Thermo Fisher Scientific，目录号：10162372）

软件

Thermo Xcalibur 软件版本 4.0.27（Thermo Scientific, MA, USA）用于数据采集（Q-exactive plus tune version 2.11）和定性（Qual Browser）和定量（Quan Browser）数据分析

程序

度洛西汀细菌培养接种
将Clostridium saccharolyticum从原种培养物（mGAM 培养基中的 20% 甘油，储存在 -80°C）中接种到 5 ml mGAM 中，并使其生长过夜。然后将其传给 5 ml GMM（肠道微生物群培养基）并过夜生长以获得预培养物。使用预培养物接种 96 深孔板（总体积在 100 和 800 µl 之间，具体取决于板尺寸）。测量接种 OD（应为 ~0.01）。
将培养板培养 48 小时并测量 OD（应在 0.8 到 1 之间）。
以 2 倍浓度（100 µM 度洛西汀）制备含药物培养基 (GMM)。制备含有细菌种类（溶糖梭菌）的培养基，也用步骤 A2 中的 2x 接种物（2x 的 OD 为 0.02）。根据不同的样品要求混合最终培养基，例如，1x 药物加 1x 细菌（在这种情况下，GMM 中 50 µl 2x 药物和 50 µl 2x 细菌的混合物）。最终浓度为 1x 细菌和 1x 药物。
在 37°C 的 C 型乙烯基厌氧室中，在含有 12% CO 2和 1% 氢气（缺氧）的氮气氛中培养培养板 48 小时。

药物提取的样品制备
孵育 48 小时后，从厌氧室中取出培养板，并将“总”培养物（培养基 + 细菌）的 10 μl 等分试样转移到新的 96 孔板中。将剩余的培养物以 4,000 × g 的速度旋转10 分钟以收获上清液。在另一个 96 孔板中分装 10 μl 的“上清液”。
将 1 ml 冷（-20°C）提取溶剂（参见配方）添加到 10 μl 总样品和上清样品的等分试样中，并在培养板（深 96 孔板）中涡旋 5 分钟（100 倍稀释）。然后，在聚丙烯深 96 孔板中用 500 μl 提取溶剂（2,000 倍稀释）进一步稀释 25 μl。
盖上盖子，在 -20°C 下孵育 15 分钟，然后在 4°C 下以 14,000 × g离心10 分钟。
从上述板中取出 100 μl 提取的上清液并转移至 WebSeal 96 孔板进行 LC-MS 分析。

标准校准曲线和质量控制 (QC) 样品制备
在 DMSO 中制备 1 μM 度洛西汀和内标库存（参见食谱）。
连续稀释度洛西汀原液以准备以下校准，使用提取溶剂中每个浓度的 2 倍稀释液。
“总培养”中的标准溶液：在细菌培养物中孵育 0、10、20、30、40、50 和 70 μM 的药物浓度。在每个浓度水平的总培养接种物中分别加入 1 ml 冷提取溶剂。以与样品的实际实验条件相同的方式制备这些标准品（如药物提取样品制备的步骤 B3 中所述）。
“上清液”中的标准溶液：通过在 4°C 下以 14,000 × g离心10 分钟，从“总培养物”上方制备上清液标准溶液。各浓度水平的上清液中分别加入1ml冷提取溶剂。以与样品的实际实验条件相同的方式制备这些标准品（如药物提取样品制备的步骤 B3 中所述）。有关样品制备的概述，请参阅图 1。

图 1. LC-HRMS 分析样品制备的总体工作流程。有关总培养的描述，请参阅程序 A。

如上文步骤 C3 和 C4 所述，分别制备 40 μM 度洛西汀的 QC 样品，用于“总培养”和“上清液”。

LC-MS/MS 分析
流动相的制备：
对于缓冲溶剂 A 和 B 制剂，请参见配方。
通过摇动和脱气在水浴超声仪中用松盖至少 10 分钟的缓冲液彻底混合每种缓冲溶剂。
将流速设置为 0.3 毫升/分钟。
将色谱柱保持在 40℃.
如下设置 LC 梯度 10 分钟：从溶剂 B 的 10% 开始 2 分钟，斜升至 90% 2 分钟，并保持 2 分钟；接下来，允许 4 分钟平衡到初始条件（溶剂 B 的 10%）。

Vanquish UHPLC-MS/MS 系统制备
在 UHPLC 系统上放置两个流动相缓冲液，并用流动相缓冲液将其清除 5 分钟。
设置 UPLC 柱并以 0.3 ml/min 的速率开始流动，两种流动相缓冲液的比例为 90:10 (A:B)。
柱压稳定后平衡柱至少 15 分钟。

MS 参数准备和 Q-exactive 加 HRMS 校准
使用扩展质量校准解决方案并使用 Xcalibur 调谐软件对质谱进行“自定义校准”。
将调谐 MS 参数设置为 ESI 正模式，如表 1 所示：

表 1. Q-exactive plus 的 MS 方法参数

LC-MS 进样序列分析
按以下方式注入 2 μl 的每个样品：
溶剂空白：将提取溶剂作为空白注入以检查仪器背景。
培养基空白：按上述步骤 B 中所述提取 GMM 培养基并注入以检查培养基中的基质背景。
孵育细菌培养空白（不含药物）：与程序 C 中提到的 0 μM 水平相同，以检查孵育后的基质背景。
注入 QC 样品至少 5 倍（与程序 C 中的 40 μM 标准溶液相同）以稳定 LC-MS 系统。

注入在上清液中制备的 10 到 70 μM 的六种标准溶液（参见程序 C）。
进样 QC 样品。
运行“总培养”样本（随机化样本序列）。
每 10 个样品后注入 QC 样品。
对上清液样品重复步骤 G3 中的相同序列。
在每个序列结束时，运行 QC 样品，然后运行标准校准曲线。

数据分析

原始数据评估
获取度洛西汀、氟西汀、磺胺二甲嘧啶和磺胺甲二唑的精确质量数提取离子色谱图 (XIC)，精度为 10 ppm，如表 2 所示。使用 Xcalibur Qual 浏览器进行原始数据可视化和质量检查。

表 2. 用于获得相应 XIC 的质子化离子 (M + H) 度洛西汀和内标的名称、分子式和精确质量

度洛西汀及其内标的代表性色谱图如图 2 所示。

图 2. 度洛西汀及其内标的代表性提取离子色谱图

使用精确质量和 MS/MS 光谱（如图 3 所示）确认度洛西汀的身份，这可以从度洛西汀的化学结构（如图 4 所示）中得到解释。有关更多 MS/MS 数据和协议，请参阅 EMBL-MCF 谱库 ( http://curatr.mcf.embl.de )。（帕尔默等人，2018 年）。

图 3. 度洛西汀标准品的 MS/MS 谱图

图 4. 度洛西汀的化学结构

使用内部标准进行质量控制评估
使用 Xcalibur Quan 浏览器从度洛西汀及其内标的 XIC 中获取峰面积。
计算整个序列中注入的 QC 样品的浓度。已知浓度和计算浓度的偏差不应大于 10%。
计算分析序列中所有样品的峰面积内标变化，不应大于 10%（如图 5 所示）。
使用氟西汀内标的峰面积对各个度洛西汀峰面积进行归一化。使用标准校准曲线的斜率计算样品中度洛西汀的浓度。

图 5. 来自 94 个细菌培养样品的内标峰面积/强度图。磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲嘧啶和氟西汀的 CV 百分比分别为 6.88、6.85 和 7.54。

食谱

萃取溶剂
在玻璃瓶中混合等体积的乙腈和甲醇（总体积 1,000 毫升）。
在萃取溶剂（乙腈和甲醇的等量混合）中为磺胺二甲嘧啶 (270 毫克)、磺胺二甲嘧啶 (278 毫克) 和氟西汀 (309 毫克) 制备 1 ml 1 µM 的内标库存溶液。
将磺胺二甲嘧啶 (100 µl)、磺胺二甲嘧啶 (40 µl) 和氟西汀 (2.5 µl) 的内标储备溶液加入 1,000 ml 萃取溶剂中，最终浓度分别为 100 nM、40 nM 和 2.5 nM。
1 µM 度洛西汀原液制备
在琥珀色玻璃小瓶中将 297.4 ± 2 mg 度洛西汀标准溶解在 1 ml DMSO 溶剂中。
1 µM 氟西汀原液制备
在琥珀色玻璃小瓶中将 309.3 ± 2 mg 氟西汀标准溶解在 1 ml DMSO 溶剂中。
流动相缓冲液制剂
缓冲液 A 的制备：将 1 ml (0.1%) 甲酸加入 1,000 ml 水中。
缓冲液 B 的制备：将 1 ml (0.1%) 甲酸加入 1,000 ml 甲醇中。

致谢

我们感谢 EMBL 代谢组学和其他核心设施，以及 EMBL Alxandrov 团队成员在该项目中的支持。
样品制备协议部分改编自 Zimmermann等人。(2019)。

利益争夺

没有相互竞争的利益。

参考

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