根际细菌群落资源利用网络的研究方法
Calculation of Trophic Network of Rhizosphere Bacterial Community   

材料与试剂

一、供试菌株

1. 野生型茄科劳尔氏菌Ralstonia solanacearum QL-Rs1115 (GenBank accession GU390462，以下简称青枯菌) 为本实验室于南京市麒麟后村发病番茄植株中分离而得，具有强的致病性 (Wei et al., 2011)。
2. 5株非致病性并与青枯菌同属的菌株也于南京市麒麟后村番茄植株中分离而得，分别是：菌株QL-A2、QL-A3、QL-A6、QL-117和QL-140。5株细菌相互之间无拮抗竞争 (不产生拮抗物质) (Wei et al., 2015)，与青枯菌QL-Rs1115之间也均无拮抗竞争 (不产生拮抗物质) (Wei et al., 2013)。所用菌株信息见表1。
   
            表1. 本研究所用菌株和质粒
   

   菌株或质粒		相关特性	GenBank号	参考文献或来源
   非致病菌	QL-A2	Ralstonia mannitolilytica	JN699058	(Wei et al., 2015)
   	QL-A3	Ralstonia mannitolilytica	KJ780056	(Wei et al., 2015)
   	QL-A6	Ralstonia pickettii	HQ267096	(Wei et al., 2015)
   	QL -117	Ralstonia taiwanensis	KJ780054	(Wei et al., 2015)
   	QL-140	Ralstonia sp.	KJ780055	(Wei et al., 2015)
   青枯菌	QL-Rs1115	Ralstonia solanacearum	GU390462	(Wei et al., 2013)

二、耗材

1. 一次性培养皿 (江苏康健医疗用品，90 mm)
2. 96孔板 (96 well costar clear)
3. 96孔板0.22 μm滤膜 (Millipore^®，MultiScreen_HTS GV Filter Plate, 0.22 µm, clear, sterile，MSGVS2210)
4. 移液枪枪头 (国产-耗材，目录号：JWD-MTB1250-5)
5. 一次性注射器 (国产-耗材，目录号：BG1327)
6. 离心管 (康健医疗，目录号：KJ307)

三、化学试剂

7. 胰蛋白胨 (OXOID，TRYPTONE，目录号：LP0042)
8. 酵母 (OXOID，目录号： LP0021B)
9. 牛肉膏 (国药集团化学试剂有限公司，沪试，目录号：69004438)
10. 乙酸 (fluorochem，目录号：044721)
11. L-丙氨酸 (上海麦恪林生化科技有限公司，麦克林，目录号：D800003)
12. β-丙氨酸 (上海麦恪林生化科技有限公司，麦克林，目录号：D800003)
13. L-精氨酸 (VETEC，目录号：V900303)
14. 抗坏血酸 (上海麦恪林生化科技有限公司，麦克林，目录号：A800295)
15. L-天冬门酰胺 (Fluorochem，目录号：M02999)
16. γ-氨酪酸 (TRC，目录号：A602920)
17. 柠檬酸 (源叶，目录号：12242)
18. 瓜氨酸 (上海麦恪林生化科技有限公司，麦克林，目录号：L805041)
19. 乙醇胺(国药集团化学试剂有限公司，沪试，目录号：81007928)
20. 甲酸 (上海晶纯生化科技股份有限公司，Aladdin，目录号：F112038)
21. 甲糖 (Santa Cruz，目录号：sc-221456)
22. 半乳糖醛酸 (索莱宝科技有限公司，索莱宝，目录号：G8120-5)
23. 葡萄糖 (国药集团化学试剂有限公司，沪试，目录号：63005518)
24. L-谷氨酰胺 (国药集团化学试剂有限公司，沪试，目录号：62010838)
25. 戊二酸 (上海麦恪林生化科技有限公司，麦克林，目录号：g822471-5g)
26. L-甘氨酸 (上海麦恪林生化科技有限公司，麦克林，目录号：G800883-500g)
27. 乙醇酸 (上海麦恪林生化科技有限公司，麦克林，目录号：g810374-100ml)
28. L-组氨酸 (上海晶纯生化科技股份有限公司Aladdin，目录号：H111055-25g)
29. 异亮氨酸 (J&K，目录号：559486)
30. 乳酸 (上海晶纯生化科技股份有限公司Aladdin，目录号：L108841-500g)
31. L-赖氨酸 (Phytotech，目录号：L594)
32. L-亮氨酸 (Caisson，目录号：L005-100GM)
33. 马来酸 (BBI，目录号：A610333-0250)
34. 苹果酸 (Phytotech，目录号：M5536)
35. 丙二酸 (国药集团化学试剂有限公司，沪试，目录号：30111926)
36. L-蛋氨酸 (J&K，目录号：945776)
37. 肌醇 (上海晶纯生化科技股份有限公司，Aladdin，目录号：i108336-25g)
38. 2-酮戊二酸 (源叶，目录号：S64994-5g)
39. L-苯丙氨酸 (J&K，目录号：162943)
40. L-脯氨酸 (国药集团化学试剂有限公司，沪试，目录号：62019936)
41. 丙酮酸 (上海麦恪林生化科技有限公司，麦克林，目录号：p815676-25g)
42. L-丝氨酸 (上海麦恪林生化科技有限公司，麦克林，目录号：d817775-25g)
43. 琥珀酸 (J&K，目录号：106413)
44. 蔗糖 (上海晶纯生化科技股份有限公司，Aladdin，目录号：s112224-5g)
45. 酒石酸 (Santa Cruz，目录号：sc-252654)
46. L-苏氨酸 (上海晶纯生化科技股份有限公司，Aladdin，目录号：t108222-25g)
47. L-色氨酸 (LGC，目录号：MM1267.01)
48. L-缬氨酸 (源叶，目录号：S67607-5g)
49. 麦芽糖 (Phytotech，目录号：m588)
50. L-阿拉伯糖 (爱必信生物科技有限公司，absin，目录号：abs47018938-20mg)
51. D-半乳糖 (TargetMOL，目录号：T0591-25mg)
52. D-甘露糖 (J&K，目录号：196857)
53. D-木糖 (J&K，目录号：203390)
54. D-核糖 (上海麦恪林生化科技有限公司，麦克林，目录号：d817221-25g)
55. D-甘露醇 (国药集团化学试剂有限公司，沪试，目录号：63008816)
56. 肌苷 (国药集团化学试剂有限公司，沪试，目录号：65009734)
57. 草酸 (J&K，目录号：391404)

四、培养基与缓冲液 (见溶液配方)

1. 胰蛋白胨大豆肉汤培养基 (Nutrient Broth)

仪器设备

1. 96道手动移液工作站 (苏州中析仪器有限公司，中析，SC9000)
2. 恒温摇床 (MIN QUAN，MQD-BIR)
3. 酶标仪 (SpectraMax M5, Sunnyvale, CA, USA)
4. -80 °C冰箱 (海尔，立式超低温保存箱，DW-86L626，2013款)
5. 离心机 (Eppendorf AG，22331 Hamburg，5424EH062551)
6. 移液枪 (Eppendorf Research plus)
7. 高压灭菌锅 (日本，鸟取，Tega SANYO Industry Co., Ltd，mlS-3780)
8. 恒温恒湿培养箱 (新苗，隔水式电热恒温培养箱，GNP-9080BS-III)
9. 天平 (sartorius BSA2202S)
10. 移液枪 (Eppendorf Research plus)
11. 涡旋仪 (SCIENTIFIC INDUSTRIES, USA)

软件和数据库

1. 本研究中将微生物不能利用的资源计做0，可利用的计做 1，以此获得二进制数组。用 R 3.1.2 (www.r-project.org) 进行资源利用网络参数的计算。

实验步骤

一、供试菌株培养与菌悬液制备

1. 从-80°C冰箱里拿出菌种，在胰蛋白胨大豆肉汤固体培养基 (Nutrient Agar, NA) 上活化。
2. 待平板上长出单菌落后，挑取平板上的单菌落转接到液体NA培养基中，30°C、170 rpm 振荡培养过夜，直至对数生长期。
3. 发酵好的菌液用0.85%无菌生理盐水洗3次以去除表面残留的培养基，具体操作：6000 rpm离心6min收集菌体，用0.85%无菌生理盐水重悬菌体，如此重复3次，最终用0.85 %无菌生理盐水调节菌液浓度为 OD₆₀₀ = 0.5 (约为10⁷ CFU·ml^-1) 。

二、菌株间拮抗能力的检测
采用点接喷雾法检测根际细菌之间以及对青枯菌QL-Rs1115的拮抗能力，具体方法如下：用无菌牙签挑取单菌落点接到NA平板的中心，培养16 h后，用装有其他菌株的菌悬液 (109 CFU·ml-1) 喷瓶喷1次 (约0.2 ml) ，30 °C培养16 h后测定抑菌圈直径D和菌落直径d，用以表征菌株之间的拮抗效果。拮抗效果计算公式如下： (D–d)/d。

三、菌株的资源利用能力的检测

1. 48种碳源包含氨基酸、有机酸、糖等，表征番茄根际环境 (或根系分泌物) 中的营养成分 (表2)。接种10 μl菌液至含有不同资源的96孔板中，孔板中资源的终浓为10 mM，最后用OS无机盐培养基 (Scheublin et al., 2010) 将孔内液体补足至200 μl。
   
           表2. 48种碳源分类
   

   编号	资源名称	资源分类
   1	乙酸	有机酸
   2	L-丙氨酸	氨基酸
   3	β-丙氨酸	氨基酸
   4	L-精氨酸	氨基酸
   5	抗坏血酸	有机酸
   6	L-天冬门酰胺	氨基酸
   7	γ-氨酪酸	氨基酸
   8	柠檬酸	有机酸
   9	瓜氨酸	氨基酸
   10	乙醇胺	其他
   11	甲酸	有机酸
   12	甲糖	糖
   13	半乳糖醛酸	有机酸
   14	葡萄糖	糖
   15	L-谷氨酰胺	氨基酸
   16	戊二酸	有机酸
   17	L-甘氨酸	氨基酸
   18	乙醇酸	有机酸
   19	L-组氨酸	氨基酸
   20	异亮氨酸	氨基酸
   21	乳酸	有机酸
   22	L-赖氨酸	氨基酸
   23	L-亮氨酸	氨基酸
   24	马来酸	有机酸
   25	苹果酸	有机酸
   26	丙二酸	有机酸
   27	L-蛋氨酸	氨基酸
   28	肌醇	其他
   29	2-酮戊二酸	有机酸
   30	L-苯丙氨酸	有机酸
   31	L-脯氨酸	氨基酸
   32	丙酮酸	有机酸
   33	L-丝氨酸	氨基酸
   34	琥珀酸	有机酸
   35	蔗糖	糖
   36	酒石酸	有机酸
   37	L-苏氨酸	氨基酸
   38	L-色氨酸	氨基酸
   39	L-缬氨酸	氨基酸
   40	麦芽糖	糖
   41	L-阿拉伯糖	糖
   42	D-半乳糖	糖
   43	D-甘露糖	糖
   44	D-木糖	糖
   45	D-核糖	糖
   46	D-甘露醇	糖
   47	肌苷	其他
   48	草酸	有机酸

   
   
2. 将96孔板放置在摇床中，30 °C、170 rpm震荡培养48h后，用酶标仪测得吸光值，若吸光值OD₆₀₀ > 0.05则认为微生物可利用孔中的碳源。

四、合成菌群的构建

1. 表3是由5株非致病菌构建的微生物群落包含了所有可能组合，包括从单一菌株至5株菌株，表示由低到高的物种多样性 (31种组合) 。采用“替代设计” (substitutive design) 理论，单一物种在所有群落中的数量均在同一水平上 (Gibson et al., 1999)。
   
           表3. 合成菌群的构建
   

   菌株 编号	QL-A2	QL-A3	QL-A6	QL-117	QL-140	多样性
   1	1	0	0	0	0	1
   2	0	1	0	0	0	1
   3	0	0	1	0	0	1
   4	0	0	0	1	0	1
   5	0	0	0	0	1	1
   6	1	1	0	0	0	2
   7	1	0	1	0	0	2
   8	1	0	0	1	0	2
   9	1	0	0	0	1	2
   10	0	1	1	0	0	2
   11	0	1	0	1	0	2
   12	0	1	0	0	1	2
   13	0	0	1	1	0	2
   14	0	0	1	0	1	2
   15	0	0	0	1	1	2
   16	1	1	1	0	0	3
   17	1	1	0	1	0	3
   18	1	1	0	0	1	3
   19	1	0	1	1	0	3
   20	1	0	1	0	1	3
   21	1	0	0	1	1	3
   22	0	1	1	1	0	3
   23	0	1	1	0	1	3
   24	0	1	0	1	1	3
   25	0	0	1	1	1	3
   26	1	1	1	1	0	4
   27	1	1	1	0	1	4
   28	1	1	0	1	1	4
   29	1	0	1	1	1	4
   30	0	1	1	1	1	4
   31	1	1	1	1	1	5

   
   

五、细菌资源竞争网络特征的计算
        微生物群落与青枯菌的资源竞争网络特征参数均由各菌株资源利用能力的结果计算而得 (详见“菌株的资源利用能力的检测”部分，图1A)。微生物群落内部的营养竞争特征用以下两个参数表征：资源利用嵌套度 (Thébault and Fontaine, 2010) 和资源利用连接度 (Galiana et al., 2014)。具体计算方式如下。

1. 资源利用嵌套度 (Nestedness，NE) 的计算：
           资源利用嵌套度用于表征资源广谱型物种 (Generalists) 与资源窄谱型物种 (Specialists) 的营养相关性。具有高嵌套结构的群落，广谱型物种可利用的资源包括了窄谱型物种可利用的资源，即后者生态位是前者生态位的子集，这将导致两者之间激烈的竞争 (图1B)。嵌套结构通过二进制数组计算得来 (Rodriguez-Girones and Santamara, 2006)，本研究中将微生物不能利用的资源计做 0，可利用的计做 1，以此获得二进制数组；资源利用嵌套度通过 R 语言中nested()计算而得。资源利用嵌套度的数值范围在 0 至 100 之间 (表示群落从随机分布到高嵌套度) 。
2. 资源利用连接度 (Connectance，CO) 的计算：
           资源利用连接度从一定程度上反映了群落的平均生态位幅度 (Average niche breadth) 。当群落存在高度的物种连接关系时，所有物种将会利用相似的资源，增加了每种资源被利用的可能性，即可理解为存在较高的平均生态位幅度；反之，各物种利用不同的资源，每种资源被利用的可能性降低，平均生态位幅度减小 (图1C) 。资源利用连接度 (CO) 可通过公式C=L/S²计算，L代表所有物种可利用的资源数，S表示物种多样性。若物种多样性为 3 的微生物群落可利用的所有资源总数为 20，则该群落的资源利用连接度为 2.22 (20/3²)。
3. 生态位重叠指数 (Niche overlap index，NOI) 的计算：
           微生物群落与青枯菌间的营养竞争特征用“生态位重叠指数”表征，通过微生物群落与青枯菌可共同利用资源数量和青枯菌可利用资源数量的比例表示 (Ji and Wilson, 2002)。生态位重叠指数越高，表示微生物群落与青枯菌之间生态位重叠度越高 (Nicheoverlap, NO) ，即营养竞争更加激烈 (图1D) 。生态位重叠指数 (NOI) 计算公式如下：
   
   
           48 种资源中，青枯菌可利用资源数量为 21 个，若微生物群落与青枯菌共同利用的资源数量为 10，则该群落与青枯菌的生态位重叠指数 (NOI) 为 0.48 (10/21)。
   
   
   图1. 营养网络模型计算原理示意图
   
           注：红色表示病原菌（青枯菌）资源利用情况，黑色表示五株本地微生物的资源利用情况；方块填充表示该物种可利用相应资源，反之，无法利用。
   

溶液配方

1. 胰蛋白胨大豆肉汤培养基
   10 g葡萄糖
   5 g胰蛋白胨
   0.5 g酵母
   3 g牛肉膏
   115 °C灭菌30 min
   

致谢

        本项工作得到了国家自然科学基金 (41301262和41471213) 、国家“973”计划 (2015CB150503) 、江苏省自然科学基金 (BK20130677) 、江苏高校优势学科建设工程项目、111项目、青蓝工程的资助。本实验流程基于已发表的论文 (Wei et al., 2015) 撰写。

参考文献

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2. Gibson, D. J., Connolly, J., Hartnett, D. C. and Weidenhamer, J. D. (1999). Designs for greenhouse studies of interactions between plants. Journal of Ecology 87(1): 1-16.
3. Ji, P. and Wilson, M. (2002). Assessment of the importance of similarity in carbon source utilization profiles between the biological control agent and the pathogen in biological control of bacterial speck of tomato. Appl Environ Microbiol 68(9): 4383-4389.
4. Scheublin, T. R., Sanders, I. R., Keel, C. and van der Meer, J. R. (2010). Characterisation of microbial communities colonising the hyphal surfaces of arbuscular mycorrhizal fungi. ISME J 4(6): 752-763.
5. Wei, Z., Huang, J., Tan, S., Mei, X., Shen, Q. and Xu, Y. (2013). The congeneric strain Ralstonia pickettii QL-A6 of Ralstonia solanacearum as an effective biocontrol agent for bacterial wilt of tomato. Biological Control 65(2): 278-285.
6. Wei, Z., Yang, T., Friman, V. P., Xu, Y., Shen, Q. and Jousset, A. (2015). Trophic network architecture of root-associated bacterial communities determines pathogen invasion and plant health. Nat Commun 6(1): 8413.
7. Wei, Z., Yang, X., Yin, S., Shen, Q., Ran, W. and Xu, Y. (2011). Efficacy of Bacillus -fortified organic fertiliser in controlling bacterial wilt of tomato in the field. Applied Soil Ecology 48(2): 152-159.
8. Núria, G., Miguel, L., José, M., and Bernat, L. (2014). Invasions cause biodiversity loss and community simplification in vertebrate food webs. Oikos 123: 721-728.
9. Rodriguez-Girones, M. A., and L. Santamaria. (2006). A new algorithm to calculate the nestedness temperature of presence-absence matrices. Journal of Biogeography 33: 924-935.
10. Thebault, E. and Fontaine, C. (2010). Stability of ecological communities and the architecture of mutualistic and trophic networks. Science 329: 853-856.