一种针对重金属污染土壤的高效DNA提取方法：去腐试剂前处理结合标准试剂盒提取
An Efficient DNA Extraction Method for Soil with Heavy-metal Contaminations: Humus Removal Reagents for Sample Pre-treatment Combined with DNA Standard Kit   

材料与试剂

1. 1 ml、5 ml枪尖、10 ml移液管
   注：为减小剪切力对核酸的损伤，可将枪尖头部稍剪一下
   
2. 50 ml聚四氟乙烯无菌高速离心管 (Nalgene，catalog number: 3114-0050)
3. 50 ml无菌注射器
4. 细菌分离液 (OptiPrep^TM，LOT#00119，4-30 °C避光保存)
5. DNA提取试剂盒A：品牌QIAGEN, PowerSoil® Pro Kit, catalog number: 47014-100，15-25 °C保存 (其中CD2保存于4 °C)；试剂盒提供的溶液与材料包括：CD1、CD2、CD3、EA、CD5、CD6，BowerBead Pro离心管，2 ml 无菌离心管、1.5 ml 洗脱管、MB Spain过滤柱
6. DNA提取试剂盒B：品牌QIAGEN, PowerSoil® DNA Isolation Kit强力土壤DNA提取试剂盒，catalog number: 12988-10；试剂盒提供的溶液与材料包括：PowerBead Solution，C1、C2、C3、C4、C5，2ml、50 ml无菌离心管，DeNase Purmax过滤柱
7. 去离子水
8. 1 M Tris-HCl缓冲液：Solarbio，catalog number: T1150，pH 8.0，常温保存
9. 0.22 µm滤膜 (Millipore, GSW04700)
10. 磷酸二氢钠二水合物：阿拉丁，S102315-250g
11. 磷酸氢二钠，无水：阿拉丁，S118443-250g
12. 氯化钠：阿拉丁，C111535-500g
13. DL15000 DNA Marker：TaKaRa，LOT#AK90932A，-20 °C保存
14. 焦磷酸盐：MACKLIN，S817837-500g (见溶液配方)
15. 吐温20：CAS [9005-69-5]，密封保存 (见溶液配方)
16. 去腐蚀剂S₀ (见溶剂配方)
17. 3 M乙酸钠 (见溶剂配方)
18. 70% 乙醇 (见溶剂配方)
    

仪器设备

1. 1 ml、5 ml、10 ml移液枪
2. 高速离心机 (均可至4 °C低温) ：
   1)

   品牌：Eppendorf，model: Centrifuge 5810R
   2)

   品牌：Eppendorf，model: Centrifuge 5417R
3. 涡旋仪：品牌Scientific Industries，model: Vortex Genie-2
4. 涡旋仪水平50 ml离心管支架：model: SI-H506
5. 电子天平：品牌HANGPING，model: JA2003N
6. 超净工作台：苏净安泰，model: YJ-1340
7. 纯水仪：美国Milli-Q型
8. 电热鼓风干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司，model: WGLL-230BE
9. 高压蒸汽灭菌器：品牌PHCBI，model: MLS-3781L-PC
10. 循环水式多用真空泵：郑州恒岩仪器有限公司，model: SHB-IIIS
11. 过滤器：品牌Nalgene，catalog number: 300-4050
12. 琼脂糖凝胶电泳仪：北京市六一仪器厂，model: DYY-6C
13. 超微量紫外分光光度计：品牌Thermo Scientific，model: NANODROP 1000
14. 真空离心浓缩仪：品牌Eppendorf，model: Concentrator plus
    

实验步骤

1. DNA提取准备工作 (Fang et al, 2015)：
   1.1

   配置DNA提取所需的去腐试剂S₀、浓度为1%的焦磷酸盐 (试剂S₁)、浓度为5%的吐温20 (试剂S₂) 与PBS缓冲液。
   1.2

   将50 ml Nalgene聚四氟乙烯高速离心管、5 ml枪尖、过滤器、去腐试剂S₀、试剂S₂与PBS缓冲液置于灭菌器内进行高压蒸汽灭菌。
   注：为防止高压灭菌后聚四氟乙烯高速离心管管体变形，管盖与管体分别灭菌
   
   1.3

   试剂S₁使用0.22 µm无菌滤膜进行过滤灭菌。
2. 样品前处理：
   2.1

   使用电子天平称取约10 g的土壤样品，装入聚四氟乙烯无菌离心管内，加入40 ml的去腐试剂S₀，使用涡旋仪用最大转速 (Speed = 10) 涡旋10 min，使样品与去腐试剂S₀充分混合。
   注：称取土壤样品的离心管必须使用可承受超速离心的无菌离心管
   
   2.2

   在转速5000 × g下离心5 min，丢弃上清液，重复2次上述步骤，直至上清液无色透明。
   注：如上清液仍然有色，可适当增加重复次数
   
3. 细胞分离与富集 (见视频操作) (Pascaud et al, 2012; Neveu et al, 2014)：
   3.1

   向经过前处理后的样品内加入2 ml 试剂S₁ (使其终浓度为0.1%)、2 ml 试剂S₂ (使其终浓度为0.5%) 以及16 ml的PBS缓冲液，使用涡旋仪 (Speed = 7) 涡旋30 min。
   3.2

   由底部缓慢加入15 ml的OptiPrep^TM细菌分离液。
   注：分3次、每次5 ml，将枪尖伸入到离心管的底部缓慢加入，切记加入后不可倒转或摇晃离心管，以防分离液与上部水体混合而导致分层失败。
   
   3.3

   提前预冷离心机至4 °C，将样品混合液在4 °C，转速8000 × g下离心30 min；离心后的混合溶液因密度差异共分为四层，由上到下依次为上层含水层、细胞层、细菌分离液层与底部土壤固体层 (图1和图2)，倘若30 min后细菌分离液层没有澄清，则延长离心时间至细菌分离液层澄清。
   
   
   图 1. 使用细菌分离液获取样品中细胞流程图
   
   
   图 2.使用细菌分离液离心后混合液分层示意图
   
   
   3.4

   使用5 ml移液枪将细胞层与上层含水层吸出，吸取时枪尖应紧贴着细胞层。
   注：切勿吸取到混合液下部的分离液层
   
   3.5

   安装抽滤装置，并使用该装置过滤3.4步骤中得到的混合液，具体步骤为：1) 提前30 min从烘箱内拿出灭菌好的滤器；2) 对操作台进行消毒，并点燃酒精灯放在合适的位置；3) 将滤器下半部分和可灭菌的滤膜支撑器拿出，放上滤膜，注意将滤膜放置在支撑器的正中；4) 将滤器上半部分与下半部分组装，组装完成后轻轻转动上半部分滤器，若不能被转动则上下部分已经扣紧；5) 转开过滤器上盖，倒入混合液，盖紧上盖并将上部气孔打开维持气压平衡；6) 连接真空泵，并开始抽滤，适当延长抽滤时间确保滤膜较为干燥；7) 将连接真空泵的管子缓慢拔出，以防止气压迅速改变而冲破滤膜；8) 将滤膜放置在冻存管内，保存在-20 ~ -80 °C冰箱中等待下一步实验操作。
   3.6

   在超净台内，将滤膜用无菌剪刀剪成小片，放入试剂盒提供的PowerBead Pro离心管内，由于47 mm滤膜较大，可将滤膜分装到两个离心管内。
   
   

   

   视频1. 样品中细菌的分离与富集

   
   
   
4. 使用DNA提取试剂盒A提取DNA：
   4.1

   向3.5步骤中的离心管内加入800 µl的CD1溶液，将其置于涡旋仪上使用最大转速 (Speed = 10) 涡旋10 min。
   4.2

   在转速15,000 × g下离心1 min，将约500 ~ 600 µl的上清液转移到另外的无菌2 ml离心管内，加入200 µl的CD2，使用涡旋仪最大转速 (Speed = 10) 涡旋5 s。
   注：CD2置于4 °C内保存
   
   4.3

   在15,000 × g转速下离心1 min，将上清液 (500 ~ 600 µl) 转移至新的无菌2 ml离心管内，加入600 µl的CD3，使用涡旋仪最大转速 (Speed = 10) 涡旋5 s。
   4.4

   取约650 µl上步得到的溶液加载至MB Spin过滤柱上，在转速15,000 × g下离心1 min，丢弃离心管下部的滤液。
   4.5

   重复4.4的操作，直至所有溶液加载并通过MB Spin过滤柱。
   4.6

   小心地将过滤柱转移至新的2 ml无菌离心管内。
   注：应避免将原本离心管下部的滤液洒入过滤柱内
   
   4.7

   向过滤柱上加入500 µl的EA溶液，在转速15,000 × g下离心1 min。
   4.8

   丢弃下部滤液，将过滤柱放回步骤4.7中使用的离心管内，向过滤柱上加入500 µl的CD5溶液，在15,000 × g转速下离心1 min。
   4.9

   丢弃下部滤液，小心地将过滤柱转移至另外的2 ml无菌离心管内。
   4.10

   在转速16,000 × g下离心2 min，小心地将过滤柱转移至新的1.5 ml洗脱管内，向过滤柱上加入50 µl的CD6溶液。
   注：尽量将液体加到过滤柱中心位置，可根据下游实验需要调整CD6溶液的用量，通常为50 ~ 100 µl；可将CD6溶液更换为无菌水。
   
   4.11

   在转速15,000 × g下离心1 min，丢弃过滤柱，提取得到的DNA存在于洗脱管内，放置于-20 °C冰箱内保存。
5. 使用DNA提取试剂盒B提取DNA (对照组)：
   按照PowerSoil® DNA Isolation Kit强力土壤DNA提取试剂盒的标准方法进行DNA提取，提取方法本文不做详细叙述。提取得到的DNA样品按下列步骤进行浓缩：
   5.1

   将提取得到的 DNA 溶液小心地分装至2 ml无菌离心管中，并置于浓缩仪内 (浓缩仪设置: 温度 25 °C，V-AQ 模式，45-55 min)，将液体体积浓缩至 0.5 ml 左右。
   5.2

   向浓缩后的DNA溶液中加入约50 µl的乙酸钠，简单涡旋使其混合均匀；再加入约2 倍混合液体积的 (约 1.1 ml) 冰冻无水乙醇，简单涡旋使其混合均匀，放置于-20 °C冰箱内大于1 h。
   5.3

   从冰箱中取出DNA混合液，在转速16,000 × g下离心10 min，小心地移除上清液；而后加入 1 ml提前预冷的70%乙醇，涡旋使其混合均匀，在转速16,000 × g下离心 2 min，小心地移除上清液，并重复一次该步骤 (窦敏娜 等，2018)。
   5.4

   将步骤5.3得到的含DNA的离心管置于浓缩仪内 (浓缩仪设置: 温度 25 °C，V-AL 模式，10 min)，去除混合液中残留的乙醇。
   5.5

   向离心管内加入 50 µl的 Tris-HCl 溶液，此时得到的DNA溶液作为与上述1-4步骤提取的DNA样品的对照。
   
   

结果与分析

图3. 两种方法提取得到的DNA电泳结果对比图A：使用本文叙述方法；B：使用试剂盒B方法；E：大肠杆菌E. coli DNA对照；N：A方法的阴性对照 (将样品放入500°C马弗炉内烘烤4 h)



图 4. 使用Nanodrop对两种方法提取得到的DNA样品质量测试结果Sample A：使用本文叙述方法；Sample B：使用试剂盒B方法

表1. 使用Nanodrop对两种方法提取得到的DNA样品浓度与质量测试结果

注意事项

1. 所有操作步骤均推荐在超净工作台内进行，实验所用剪刀均需提前浸泡于75%的酒精内，所用离心管与枪尖均需提前进行高温蒸汽灭菌 (121 °C，30 min)，避免对样本微生物造成污染。
2. 当同时使用涡旋仪震荡的离心管数目过多时，可增加5 ~ 10 min的涡旋时间，以保证所有离心管能够充分震荡混合。
3. 加入细菌分离液时应将枪尖小心地伸入离心管的底部，且在加入时缓慢上移枪尖，防止样品撒出；加入细菌分离液之后应避免震荡离心管。
4. 使用转速14,000 × g进行离心前离心管应严格配平 (离心管之间质量差< 0.01 g)，需使用50 ml聚四氟乙烯离心管或可承受超速离心的无菌离心管，降低超速离心对离心机的损害，且避免离心管的破裂。
   

溶液配方

1. PBS缓冲液
   
   按上表称取试剂，加入200 ml的去离子水，搅拌溶解，加入NaOH或者HCl调节pH到7.4，然后定容至1 L，高压蒸汽灭菌灭菌，常温保存。
   
2. 1% (wt/v) 的焦磷酸盐 (试剂S₁)
   称取1 g焦磷酸盐固体用PBS定容至100 ml使用0.22 µm滤膜过滤灭菌，常温保存。
   
3. 5% (v/v) 的吐温20 (试剂S₂)
   量取5 ml吐温20溶液用PBS定容至100 ml，高压蒸汽灭菌，常温密封保存。
   
4. 去腐试剂S_{0
   1) 配置1 M NaH2PO4：称取1.56 g NaH2PO4·2H2O固体加入10 ml去离子水内，搅拌溶解。
   2) 配置1 M Na2HPO4：称取23.20 g Na2HPO4·5H2O固体加入100 ml去离子水内，搅拌溶解。
   3) 混合6.8 ml NaH2PO4与93.2 ml Na2HPO4，使用NaOH调节pH至8.0。
   4) 配置0.5 M EDTA：称取37.44 g EDTA固体加入200 ml去离子水内，调节pH至8.0使其溶解。
   5) 配置5 M NaCl：称取87.66 g NaCl固体加入300 ml去离子水内，搅拌溶解。
   6) 混合3)、4)、5) 与100 ml Tris-HCl，加入去离子水定容至1 L。
   7) 所得混合溶液即为去腐试剂S0，将S0高温蒸汽灭菌，常温保存。}
   
5. 3 M乙酸钠
   称取 40.8 g 的三水合乙酸钠，用去离子水定容至100 ml，搅拌待其完全溶解后，加入HCl 将pH调整至5.2，高压蒸汽灭菌，置于阴凉处室温保存。
   
6. 70%乙醇
   将无水乙醇与去离子水按7:3 (v/v) 混合，置于4 °C冰箱内保存。
   

致谢

感谢国家自然科学基金项目“微生物—粘土矿物—重金属铀与铬相互作用过程”与教育部—中国地质大学 (北京) 求真研究群体“极端环境生物地球化学群体”对本研究方法的资助。

参考文献

1. 窦敏娜. (2018). 重金属污染环境土壤细菌总DNA提取方法探索. 陕西农业科学 64(05): 37-38, 52.
2. Fang, Y., Xu, M. Y., Chen, X. J., Sun, G. P., Guo, J., Wu, W. M. and Liu, X. D. (2015). Modified pretreatment method for total microbial DNA extraction from contaminated river sediment. Front Env Sci Eng 9: 444-452.
3. Pascaud, A., Soulas, M. L., Amellal, S. and Soulas, G. (2012). An integrated analytical approach for assessing the biological status of the soil microbial community. Eur J Soil Biol 49: 98-106.
4. Neveu, M., Poret-Peterson, A. T., Lee, Z. M. P., Anbar, A. D. and Elser, J. J. (2014). Prokaryotic cells separated from sediments are suitable for elemental composition analysis. Limnol Oceanogr: methods 12(7): 519-529.