从环境样本中提取高质量DNA-研磨加DNeasy试剂盒方法
DNA Extraction from Environment Samples – Grind Plus Kit Method   

材料与试剂

1.  DNA提取缓冲液Extraction buffer
   
   1.1

   6.8 ml 1 M NaH₂PO₄ (一价)
   1.2

   93.2 ml 1 M Na₂HPO₄ (二价)
   注：在磷酸盐溶液中加入NaOH溶液直至pH为8，再加入剩余溶液
   1.3

   200 ml 0.5 M EDTA, pH 8.0
   1.4

   100 ml 1 M Tris-HCl, pH 8.0
   1.5

   300 ml 5 M NaCl
   1.6

   100 ml 10% CTAB (对于过滤样本，不要使用CTAB)
   加入去离子水至1 L；如果不加CTAB，加入去离子水至900 ml
   (终浓度：0.1 M NaH₂PO₄, 0.1 M Na₂HPO₄, 0.1 M EDTA, 0.1 M Tris-HCl, 1.5 M NaCl, 1% CTAB)
2.  其它需要的化学物质
   
   2.1

   10 mg/ml蛋白酶 K (Proteinase K) (储藏在-20 °C)
   2.2

   20% SDS (预制)
   2.3

   70%冰乙醇 (储藏在-20 °C)
   2.4

   2-异丙醇
   2.5

   0.5 M EDTA, pH 8.0
   2.6

   1 M Tris-HCl
   2.7

   *100× TE (Sigma, catalog number: T9285-100ML)
   2.8

   *(可选) 氯仿：异戊醇 (24:1)
   注：将氯仿和异戊醇混合后储存在深色的或包裹锡箔纸的瓶子里，并放在通风橱的防燃柜里
3.  试剂盒Kit
   MO BIO PowerClean® Pro DNA Clean-Up Kit (MO BIO, catalog number: 12997-50) 或者 MO BIO PowerSoil® DNA Isolation Kit (MO BIO, catalog number: 12888-100 or 12888-50), 现在是DNeasy® PowerClean® Pro Cleanup Kit (50) (QIAGEN, catalog number: 12997-50) 或者 DNeasy® PowerSoil® Kit (QIAGEN, catalog number: 12888-100) (图1)
    
   
   图1. DNA提取试剂盒DNeasy® PowerSoil® Kit (QIAGEN, catalog number: 12888-100)
   
   
   
4.  其它说明
   本方法中使用的Oak Ridge tubes (图2) 不要进行高压蒸汽灭菌。因为DNA分子在经过高温蒸汽灭菌的Oak Ridge tubes中难以聚集成紧密的颗粒，以至于肉眼不可见。使用后用去离子水冲洗，并在去离子水中煮沸20 min。冷却后，用70% 乙醇冲洗试管并干燥。
   
   
   图2. Oak Ridge tube

仪器设备

1.  移液枪
2.  离心机 (图3，图4)
   
   
   图3. 2 ml离心管离心机
   
   
   图4. 15 ml离心管离心机
   
   
3.  Nanodrop
4.  涡旋仪 (图5)
   
   
   图5. 涡旋仪
   
   
5. 水浴锅
   

实验步骤

1.  称出1 g样品到无菌研钵中 (使用 6-10 cm 直径的研钵。每次只取出一个样品，以尽量减少DNA在室温下的降解)，再加入0.5 g无菌石英砂到研钵中。石英砂可酌情增加用量。在研钵中加入足够液氮快速冷却石英砂和研钵。
   注：如果1 g土壤样品不够用，可在以下步骤中增加土壤样品用量和按比例增加试剂量 (如DNA提取缓冲液、蛋白酶K、SDS和异丙醇等)。本方案也适用于其他类型的环境样品 (污泥、水、木材等)，但样品量要视情况而定。
2.  开始研磨样本，如果加入的液氮太少已经消耗完，立即加入新的的液氮。研磨样品时尽量控制在研钵里的一个小区域。一直研磨直到样品开始融化。研磨时尽可能保持样品处于冷冻状态。
   注：如果样品冷冻后结块难以研磨，可以放置稍微解冻，但一定要加入0.2~0.4 ml的DNA提取缓冲液，记录准确的使用量V1。当温度升高时，缓冲液可以抑制DNA降解。
3.  重复步骤2冷冻研磨2次 (共三次)。
4.  当样品仍处于冷冻状态时，用刮刀把样品集中到研钵的中心 (如有必要，加入更多的液氮让保持样品冷冻)。转移样本到新的15 ml离心管中。
   注：此时如果不能立即进行DNA提取，样品要保存在-80 °C，直到准备好进行下一步的DNA提取。
5.  在上述准备好的样品中加入3.3 ml DNA提取缓冲液 (含有CTAB)。缓冲液的总容量应该是3.3 ml，如果在冷冻研磨过程中添加过该缓冲液，并且使用量为V1 ml，这一步添加的缓冲液体积为（3.3-V1）ml。
   注：如果土壤杂质太多，但含有足够的DNA，可以增加缓冲液总体积至5 ml。
6.  加入12.2 ml蛋白酶K (10 mg/ml)，轻轻地混合。
   注：如果在第5步中加入5 ml缓冲液，则加入18.5 µl蛋白酶K。
7.  37 °C水浴30 min，期间5-10 min倒转混合一次。
8.  加入0.37 ml 20%的SDS，轻轻地混合。
   注：如果在第5步中加入5 ml缓冲液，则加入0.56 ml 20%的SDS。
9.  65 °C水浴2 h，每15-30 min轻柔地倒转混合一次。
10.  25 °C离心20 min，6,000 × g 。
11.  转移上清液到Oak Ridge tubes中 (使用半透明的Oak Ridge tubes)，尽量不要碰到白色的表层。
    注：如果样品中有太多的有机杂质 (如蛋白质)，可以转移上清液到15 ml锥形离心管中用于氯仿提取。
12.  加入1.2 ml DNA提取缓冲液 (含有CTAB) 到剩余的沉淀中涡旋混匀。
    注：如果在第5步中加入5 ml缓冲液，则加入1.8 ml含有CTAB的DNA提取缓冲液。
13.  加入0.13 ml 20%的SDS，轻柔地混合。
    注：如果在第5步中加入5 ml缓冲液，则加入0.2 ml 20%的SDS。
14.  65 °C水浴静置15 min.
15.  25 °C离心20 min，6,000 × g。
16.  转移上清液与 (11) 所得上清液混合，转移过程中避免碰到白色表层。
    注：如果样品中有太多的有机杂质 (如蛋白质)，在下一步之前，加入与上清液等体积的1:24氯仿：异戊醇混合液，在通风橱中用圆盘旋转混匀仪连续倒转混合5-10 min。3,700 × g 离心20 min。转移上清液到一个新的锥形离心管中。加入新的等体积氯仿：异戊醇再萃取一次。然后转移上清液到Oak Ridge tubes中。
17.  加入0.6个体积的2-异丙醇 (使用量要精准控制在0.6个体积)。
18.  在-20或-80 °C冰箱中静置过夜。低温有助于DNA沉淀。
19. 从冰箱取出样品，37 °C水浴加热。在进行下一步之前，确保样品是完全加热的并且所有的沉淀都溶解了。在离心前加热样本可以溶解静置一整夜产生的所有矿物沉淀。
    注：尽可能彻底地溶解所有矿物沉淀，大概需要30~45 min。
20.  25 °C室温15,000 × g (RCF) 离心20 min (确保离心机处于室温状态，如果温度太低，样品中的矿物沉淀就会析出)。离心后立即将上清液转移到新的离心管中 (保留上清液直到通过后续步骤确认得到DNA，否则需要重复这一步)。
21.  在Oak Ridge tubes的DNA沉淀中加入1 ml 70%冰乙醇清洗DNA沉淀。15,000 × g 离心5 min，去掉乙醇。
    注：如果DNA沉淀杂质太多，可以清洗两次。可以使用移液枪尽可能彻底地去除乙醇。一些纯净的DNA可能是不可见的。如果去除乙醇之前不离心或者下一步中不充分溶解DNA就转移，就有可能损失一部分DNA。
    
    21.1

    如果使用的是Mobio PowerClean Pro kit或者DNeasy® PowerClean® Pro Cleanup Kit。
    

    1)

    加入100 µl 1× TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA.Na2, pH = 8, sterile, DNase free) 用于溶解DNA。充分混合确保所有的DNA都溶解了。转移DNA溶液到1.5 ml离心管。
    注：充分溶解DNA是非常重要的。移液枪吹打比涡旋更能有效地溶解DNA如果DNA难以溶解，可以50 °C水浴2-5 min。在一些情况下，可以将粗DNA稀释到1/2-1/10，这样下一步中使用100 μl稀释的DNA，腐殖质的浓度也不会超出试剂盒的去除范围。

    2)

    接下来就是按照PowerClean Pro kit 的标准流程来纯化DNA。此外，在这个试剂盒中，我们会使用1x TE (pH = 8.0) 或者去离子水 (DNase free) 代替DC5溶液。
    注：PowerClean Pro kit 的DNA纯化流程: http://www.mobio.com/images/custom/file/protocol/12997-50.pdf. DC5试剂不含有EDTA，如果下一步使用的DNA对EDTA是敏感的，可以使用DC5。而1× TE更适合长期保存。但是，如果想从Nanodrop中得到准确的260/230值，还是使用去离子水 (DNase free)洗脱DNA更好。Nanodrop检测后，可加入1/100 (v/v) 100x TE，得到1x TE的DNA样本，供长期保存。

    3)

    用Nanodrop检测DNA纯度。260/280 ~ 1.8, 260/230 ≥ 1.7.
    注：如果260/230数值不好，可以参考http://ieg.ou.edu/protocol.html (page 10, Desalting protocol) 中的“Community DNA Preparation through hybridization”进行脱盐。如果DNA浓度过低，则很难通过酸化和冷乙醇沉淀DNA。可以将DNA浓缩到100 ng/μl 左右，沉淀DNA，用10~20倍体积70%冷乙醇洗涤DNA颗粒。如果260/230或260/280数值都不够好，尝试重复使用PowerClean Pro kit再纯化一次。

    4)

    用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整程度 (0.8% agrose, 105 V, 30 min)。
    21.2

    如果使用的是PowerSoil kit或者 DNeasy® PowerSoil® Kit：
    

    1)

    在离心后的DNA沉淀中加入430 µl bead solution (DNeasy PowerSoil kit, 在bead tube) 用于溶解DNA。充分混合以确保DNA完全溶解。
    注：充分溶解DNA是非常重要的。移液枪吹打比涡旋更能有效地溶解DNA。如果DNA难以溶解，可以50 °C水浴2-5 min。在一些情况下，可以将粗DNA稀释到1/2-1/10，这样下一步中使用100 μl稀释的DNA，腐殖质的浓度也不会超出试剂盒的去除范围。之后步骤中的试剂来自于DNeasy PowerSoil kit。

    2)

    加入250 µl试剂C2，涡旋5 s混合均匀，4 °C冰箱中静置5 min。

    3)

    10,000 × g 离心1 min。转移650 µl到一个新的离心管中。

    4)

    加入200 µl试剂C3，涡旋5 s混合均匀，4 °C冰箱中静置5 min。

    5)

    10,000 × g 离心1 min。转移700~750 µl到一个新的2 ml离心管中。
    注：如果在试剂C3处理之后溶液不是无色的 (比如棕色)，可以重复步骤21.2中的 4) 和 5)，加入另外的200 µl试剂C3以提高DNA纯度。然而，在某些情况下如果重复使用C3，DNA会大量丢失。

    6)

    加入1.2 ml试剂C4，涡旋5 s混合均匀。
    注：使用试剂C4之前要记得摇匀。

    7)

    在Spin filter的柱子中加入675 µl的样本10,000 × g 离心1 min，去除过滤掉的液体。使用相同的Spin filter重复本步骤两次 (共三次)。

    8)

    加入500 µl试剂C5到Spin filter的柱子中，在10,000 × g 离心30 s。去除过滤掉的液体。如果你的样品不是无色的，重复这一步。
    注：一般而言，试剂C5的洗涤次数不超过两次。不然260/230数值可能不会太好。

    9)

    再一次在10,000 × g 离心Spin filter 1 min。小心地将Spin filter的柱子转移到一个新的2 ml离心管中。
    注：如果有试剂C5残留在柱子壁上，可以用干净的kimwipes纸巾吸干。

    10)

    加入100 µl去离子水 (DNase free) 到Spin filter的柱子里10,000 × g 离心30 s。去掉Spin filter。
    注：C6 试剂不含有EDTA，如果下一步使用的DNA对EDTA是敏感的，可以使用C6。而1× TE更适合长期保存。但是，如果想从Nanodrop中得到准确的260/230值，还是使用去离子水 (DNase free) 洗脱DNA更好。Nanodrop检测后，可加入1/100 (v/v) 100x TE，得到1x TE的DNA样本，供长期保存。

    11)

    使用Nanodrop确认DNA纯度260/280 ~ 1.8, 260/230 ≥ 1.7.
    注：如果260/230数值不好，可以参考http://ieg.ou.edu/protocol.htm (page 10, Desalting protocol) 中的“Community DNA Preparation through hybridization”进行脱盐。如果DNA浓度过低，则很难通过酸化和冷乙醇沉淀DNA。你可以将DNA浓缩到100 ng/μl左右，沉淀DNA，用10~20体积70%冷乙醇洗涤DNA颗粒。如果260/230或260/280数值都不够好可以重复步骤21.1中的 1) 到 11)，在 1) 中使用330 μl bead solution。
22.  用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整程度 (0.8% agrose, 105 V, 30 min)。
    

结果与分析

最后得到的DNA 260/280的值在1.8-2.0之间，260/230 ≥ 1.7。一般只要严格按照本方案的每一个细节进行操作，不会出现杂质过多的问题。

致谢

感谢国家自然科学基金 (U1906223)，中国科学院前沿科学重点研究项目 (QYZDB-SSW-DQC026) 的资助。感谢已使用过本实验方案的文章 (Wang et al., 2019) Elevated temperature overrides the effects of N amendment in Tibetan grassland on soil microbiome. Soil Biology and Biochemistry, 136: 107532。

参考文献

1. Costea, P., Zeller, G., Sunagawa, S. Pelletier, E., Alberti, A, Levenez, F., Tramontano, M., Driessen, M., Hercog, R. and Jung, F.E. (2017). Towards standards for human fecal sample processing in metagenomic studies. Nature Biotechnology, 35, pages1069-1076.
2. Zhou, J.Z., Bruns, M.A. and Tiedje, J.M. (1996). DNA recovery from soils of diverse composition. Applied and Environmental Microbiology 62, 316.