猪肠道食糜和血清中短链脂肪酸浓度的测定
The Determination of the Concentration of Short Chain Fatty Acids in the Intestinal Digesta and Serum of Pigs   

材料与试剂

1. 2 ml一次性无菌注射器 (洪湖泰宁医疗器械有限公司)
   
2. 0.22 μm有机尼龙针式过滤器 (成都思为科学仪器有限公司)
   
3. 毛细管柱 (HP-FFAP，柱长30 m，柱内径0.53 mm，膜厚1 μm) (Agilent)
   
4. 乙酸 (分析标准品)，(Supelco, Sigma-aldrich, catalog number: 71251)
   
5. 丙酸 (分析标准品)，(Supelco, Sigma-aldrich, catalog number: 94425)
   
6. 丁酸 (分析标准品)，(Supelco, Sigma-aldrich, catalog number: 19215)
   
7. 异丁酸 (分析标准品)，(Supelco, Sigma-aldrich, catalog number: 46935-U)
   
8. 戊酸 (分析标准品)，(Supelco, Sigma-aldrich, catalog number: 75054)
   
9. 异戊酸 (分析标准品)，(Supelco, Sigma-aldrich, catalog number: 78651)
   
10. 巴豆酸 (纯度98%)，(Sigma-aldrich, catalog number: 113018)
    
11. 甲醇 (色谱纯)，(Fisher, catalog number: A452-4)
    
12. 偏磷酸 (分析纯)，(天津科密欧化学试剂有限公司, catalog number: 00500)
    
13. 210 mmol/L 巴豆酸 (见溶液配方)
    
14. 25% (w/v) 偏磷酸 (见溶液配方)
    
15. 标准储备液 (见溶液配方)
    
16. 实验1标准工作液 (见溶液配方)
    
17. 实验2标准工作液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 气相色谱仪 (Varian, GC CP3800)
   
2. 高速冷冻离心机 (Thermo, Heraeus, Biofuge Primo R)
   
3. 手动进样针 (Agilent, 10 μl)
   
4. 旋涡混合器 (上海青浦沪西仪器厂，XW-80A)
   
5. 移液器 (Eppendorf, 10 μl, 20 μl, 100 μl, 200 μl, 1,000 μl)
   
6. 纯水仪 (Millipore, Milli-Q Integral 3)
   
7. 电子天平 (Mettler Toledo, ME204E)     
   

实验步骤

一、食糜及粪便中挥发性脂肪酸的测定

1. 食糜或粪便样品前处理
   将事先采好的结肠、盲肠食糜或粪便样品解冻，搅拌混匀，均匀称取约0.7 g样品 (准确记录质量m0) 于2 ml离心管，加入1.5 ml (V₀) 超纯水，涡旋混匀，静置30 min，该浸提过程在冰上完成。10,000 × g 离心15 min，取1 ml (V₁) 上清加入0.2 ml (V₂) 25% (w/v) 偏磷酸溶液、23.3 μl (V₃) 210 mmol/L巴豆酸溶液，混匀后4 °C放置孵育30 min，之后8,000 × g 离心10 min。离心后取0.3 ml (V₄) 上清加入0.9 ml (V5) 色谱甲醇，涡旋混匀，8,000 × g 离心5 min，取上清用0.22 μm针式过滤器过滤至1.5 ml EP管中，上机检测。
           检测小肠食糜时，由于SCFA含量较低，前处理需做适当浓缩处理：巴豆酸加入量 (V₃) 为15.2 μl, V4和V5的比值为1:1，对应标准工作液中加入巴豆酸的体积为80 μl，其他不变。
           样品中乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸的含量w分别为
   
           (X为上机测定值，单位mmol/L；M分别为乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸的摩尔质量60.05 g/mol、74 g/mol、88.11 g/mol、88.11 g/mol、102.13 g/mol、102.13 g/mol)
   

2. 气相色谱测定
    色谱条件：进样口温度220 °C，进样量1 μl，分流比50:1；载气为高纯N₂，柱流量1 ml/min；FID检测器温度250 °C，燃气高纯H₂流量40 ml/min，助燃气零级空气流量400 ml/min，尾吹气高纯N₂流量35 ml/min；色谱柱HP-FFAP，柱温箱程序升温：起始温度100 °C，以20 °C/min的速度升温至190 °C，保持0.5 min，运行时间5 min。
           该条件下进行方法学验证，进行线性、检测限、重现性和加标回收率测定。
   

二、血清中挥发性脂肪酸的测定

1. 血清样品前处理
   取400 μl (V₁) 血清加入50 μl (V₂) 25% (w/v) 偏磷酸溶液和4 μl (V₃) 21 mmol/L巴豆酸溶液，混匀后4 °C放置30 min，10,000 × g 离心10 min，取上述溶液200 μl (V₄) 与200 μl (V₅) 甲醇混匀，8,000 × g 离心15 min，用0.22 μm微孔滤膜过滤至EP管中，上机测定。则血清中乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸的含量w分别为
   ,
   (X为上机测定值，单位μmol/L)
   

2. 气相色谱测定
   色谱条件：进样口温度220 °C，进样量1 μl，分流比50:1；载气为高纯N₂，柱流量1 ml/min；色谱柱HP-FFAP，柱温箱程序升温：起始温度80 °C，维持1.5 min，以45 °C/min的速率升温至125 °C，维持2.5 min，再以40 °C/min的速率升温至170 °C，再以80 °C/min的速率升温至225 °C，维持1 min，运行时间7.81 min。FID检测器温度250 °C，燃气高纯H₂流量40 ml/min，助燃气零级空气流量450 ml/min，尾吹气高纯N₂流量35 ml/min。
           该条件下进行方法学验证，进行线性、检测限、重现性和加标回收率测定。
   

注意事项

1. 由于食糜样品冻存后分层，处理样品前，需在解冻后用小号药匙或牙签等充分搅拌混合均匀再取样，若直接挖取冰冻固体样品，所得结果不能反映真实值。
2. 为防止SCFA挥发，样品解冻过程不能加热，解冻时样品管应密封。
3. 测定食糜中的SCFA，当样品量较少时，可适当缩减称样量和提取溶剂体积，准确记录，后续步骤中涉及的溶液体积须等比例变化。
4. 为保证测得的SCFA含量在气相色谱标准曲线线性范围内，性质不同的样品称样量、加水量均需测试。由于微生物主要在后肠进行发酵，本实验涉及对象可为结肠、盲肠食糜和粪便样品。如所测样品中SCFA含量极低，需调整标准曲线范围及内标浓度。
5. 由于血清样品成分复杂，目标物含量相对较低，色谱积分区间尽可能设小，以防杂峰干扰或得到伪数据。
6. 建议检测血清SCFA时采用厚液膜 (1-1.5 μm) 的极性毛细管柱，因为厚液膜毛细管柱有更强的保留性能和柱容量，液膜越厚，保留性能越强，可在一定程度上提高柱效和色谱响应值。沸点低的化合物或物质 (如血清) 保留性能较弱，采用膜厚1 μm以上的毛细管柱对于200 °C以下的复杂样品有更好的分离度。
7. 血清SCFA检测对仪器状态要求高，进样口和毛细管柱均需维持在最佳状态。建议每测20个样品后，回测一针中等浓度标准品，比对前后进样的色谱响应值，以保证样品的响应值无降低，确保数据的可靠性。
   

结果与分析

一、食糜SCFA测定的色谱方法学验证

1. 色谱分离能力
   当前色谱条件下，乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸混合标准品在5 min内完成分离，如图1A所示，保留时间分别为2.970、3.379、3.504、3.823、4.024、4.378 min，内标物巴豆酸的保留时间为4.617 min。各组分完全分离，色谱峰窄、无拖尾。该条件应用于结肠食糜样品，如图1B所示，各组分同样得到有效分离，峰形良好。
   
    
   图1. 猪结肠食糜和粪便样品中的SCFA分离色谱图 A. 混合标准品 B. 母猪的结肠食糜样品
   

2. 线性
   如表1所示，线性范围满足肠道食糜SCFA的测定需求。线性范围内，6种SCFA的线性良好。
   
   表1. 食糜中SCFA测定标准曲线及线性范围
   

   组分	标准曲线	线性相关系数r值	线性范围
   乙酸	y = 3.27x + 1.25	1	2.41-12.03 mmol/L
   丙酸	y = 6.42x - 2.20	0.999	0.79-3.97 mmol/L
   异丁酸	y = 7.14x + 4.98	0.999	0.32-1.59 mmol/L
   丁酸	y = 9.27x - 8.07	0.999	0.32-1.59 mmol/L
   异戊酸	y = 1.26x + 2.25	0.998	0.31-1.54 mmol/L
   戊酸	y = 1.29x - 5.04	0.999	0.31-1.54 mmol/L

   
   

3. 检测限
   该方法下乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸的检测限分别为0.05 μmol/L、0.08 μmol/L、0.06 μmol/L、0.32 μmol/L、0.01 μmol/L、0.03 μmol/L。
   

4. 重现性
   该方法下乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸的样品测定重现性良好，变异系数分别为5.57%、4.61%、2.1%、4.58%、5.73%、4.24%。
   

5. 加标回收率
   该方法下乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸的样品加标回收率分别为90.8%、94.0%、99.0%、95.8%、93.3%、89.6%。
   

二、血清SCFA测定方法学验证结果

1. 色谱分离能力
   当前色谱条件下，乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸混合标准品在7.5 min内完成分离，如图2A所示，保留时间分别为5.164、5.826、5.999、6.348、6.532、6.804 min，内标物巴豆酸的保留时间为6.954 min。各组分完全分离，且峰形良好。该条件应用于仔猪血清样品，如图2B所示，各组分同样得到有效分离，峰形良好。
   
    
   图2. 血清中的SCFA测定色谱图 A. 标准品 B. 仔猪血清样品
   
   

2. 线性
   如表2所示，由于猪血清样品中的SCFA含量极低，建议在绘制标准曲线时包括原点。
   
   表2. 血清中SCFA测定标准曲线及线性范围
   
   

3. 检测限
   该方法下乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸的检测限分别为0.03 μmol/L、0.18 μmol/L、0.04 μmol/L、0.18 μmol/L、0.01 μmol/L、0.03 μmol/L。
   

4. 重现性
   该方法下血清中乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸测定的变异系数分别为11.76%、10.48%、13.91%、10.23%、14.14%、8.45%，较食糜中变异大，但仍在可接受范围内，符合生物样本的分析要求。
   

5. 加标回收率
   该方法下乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸的血清样品加标回收率分别为75.65%、129.56%、126.50%、92.52%、101.40%、83.01%。血清中SCFA回收率较食糜低，主要是血清中干扰物多、目标物含量低导致。
   

失败经验

由于本实验采用的是进样针直接进样，在检测血清等成分复杂的样品时容易导致进样口和毛细管柱前端污染，色谱响应值变低。因此，大约测定50个 (取决于色谱柱和样品的洁净度) 样品后，需停止测样，检查进样口和毛细管柱前端，并及时更换衬管，切掉部分毛细管柱前端，老化后重新检测标准品，待响应值恢复即可重新开始检测血清等样品。
测定血清SCFA时用标准液膜毛细管柱得到的信号响应值低，分离不理想，误差较大，建议用固定相液膜厚度大于0.5 μm的FFAP柱。FFAP毛细管柱固定相为硝基对苯二酸改性的聚乙二醇，具有强极性，适合做弱酸性的强极性化合物分离。厚液膜固定相有更大的柱容量和更强的保留能力，更适用于低沸点化合物的分离。

溶液配方

1. 210 mmol/L巴豆酸
   称取1.808 g巴豆酸用纯水溶解，并定容至100 ml容量瓶，4 °C保存。实验2中巴豆酸为21 mmol/L，即将上述巴豆酸溶液稀释10倍。
   

2. 25% (w/v) 偏磷酸
   取25 g偏磷酸用纯水溶解，并定容至100 ml容量瓶，4 °C保存。
   

3. 标准储备液
   用移液枪移取标准品，并用电子天平准确称取0.91 g乙酸、0.37 g丙酸、0.177 g丁酸和异丁酸、0.199 g戊酸和异戊酸溶于纯水，混匀后转移并定容至100 ml，得到浓度分别为151.54、50.00、20.03、20.03、19.44、19.44 mmol/l的混合标准品溶液，4 °C保存。
   

4. 实验1标准工作液
   取5个1.5 ml的EP管，分别加入1.0、0.8、0.6、0.4 ml和0.2 ml混合标准储备液，以及0、0.2、0.4、0.6 ml和0.8 ml超纯水，得到5个梯度的中间液。
   向中间液中分别加入0.2 ml 25%偏磷酸溶液、60 μl 210 mmol/L巴豆酸溶液，混匀，4 °C放置30 min, 10,000 × g 离心10 min，取上清液0.1 ml加入0.9 ml色谱甲醇，混匀后8,000 × g 离心，取上清经0.22 μm有机滤膜过滤后备用。此时5个水平的标准工作液浓度见表3。标准工作液现用现配。
   
   表3. 实验1标准工作液浓度 (mmol/L)
   
   
   

5. 实验2标准工作液
   取40 μl混合标准储备液加入960 μl超纯水，即稀释25 倍。取5个1.5 ml的EP管，分别取10、25、50、100、200 μl上述溶液，加超 纯水稀释到1,000 μl，混匀得到标准中间液。取中间液400 μl分别加入50 μl 25%偏磷酸溶液，4 μl 21 mmol/L巴豆酸溶液，混匀，4 °C放置30 min，10,000 × g 离心10 min，取上清液250 μl与250 μl甲醇混匀，10,000 × g 离心15 min。上清经0.22 μm滤膜过滤后备用。此时5个水平的标准工作液的浓度见表4。标准工作液现用现配。
   
   表4. 实验2标准工作液浓度 (μmol/L)
   
   

致谢

本工作受国家自然科学基金 (31872369、32072743) 和四川农业大学双支计划项目资助，特致感谢！目前已应用本实验方案发表文章20余篇，部分如下：

1. Zhao, Y. M., Tian, G., Chen, D. W., Zheng, P., He, J., Mao, X. B., Huang, Z. Q., Luo, Y. H. and Yu, B. (2020). Dietary protein levels and amino acid supplementation patterns alter the composition and functions of colonic microbiota in pigs. Anim Nutr 6: 143-151.
2. Hu, Y. L., Yu, B., Yan, H., Zheng, P., Mao, X. B., Yu, J., He, J., Huang, Z. Q., Luo, Y. H., Luo, J. Q. and Chen, D. W. (2020). Effects of dietary fibres on gut microbial metabolites and liver lipid metabolism in growing pigs. J Anim Physiol Anim Nutr 00: 1-10.
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