枫香-真菌互作培养体系构建
Method for Constructing Liquidambar Styraciflua, Root Fungus Interaction System   

材料与试剂

1. 纱布
2.  滤纸
3. 封口膜
4.  泥炭土
5.  珍珠岩
6. 蛭石
7. 有机肥
8.  ddH₂O
9.  超纯水
10.  WPM粉末 (EKEAR)
11. 11.改良MS培养基 (见溶液配方)
12. 20× 大量元素母液 (见溶液配方)
13.  100× 微量元素母液 (见溶液配方)
14.  100× 铁盐母液 (见溶液配方)
15.  100× 有机化合物母液 (见溶液配方)
16.  IBA母液 (见溶液配方)
17.  0.85%生理盐水 (见溶液配方)
18.  0.1%升汞 (见溶液配方)
19. PDA培养基 (见溶液配方)
20.  WPM培养基 (见溶液配方)

仪器设备

1.  接种针
2. 毛刷
3.  剪刀
4.  镊子
5.  漏斗
6.  锥形瓶
7. 移液枪
8.  血球计数板
9.  打孔器 (直径7 mm)
10. 试管 (25 mm × 240 mm)
11. 大培养皿 (直径15 cm)
12.  光学显微镜 (Carl Zeiss, model: Axio Scope A1)
    
13. 光照培养箱 (宁波扬辉，model: RDN-1500B)
14. PhytatrayTMⅡ培养容器 (sigma, catalog number: P5929)
15.  立式压力蒸汽灭菌器 (上海申安，model: LDZF-50KB-II)
    
    

实验步骤

1. 真菌接种剂的准备
   
   1.1

   菌饼接种剂准备
   

   1)

   PDA培养基灭菌后取出，室温下放置，待培养基温度约45 °C后，倒入一次性塑料培养皿中，待培养基凝固后，进行接种处理。

   2)

   从纯培养真菌平板菌落边缘用接种针挑取菌块，转移至PDA固体培养基上26 °C黑暗条件下培养。

   3)

   待培养7 d后，自菌落边缘使用打孔器 (直径7 mm) 取菌饼作接种剂。

   
   
   1.2

   孢子悬浮液接种剂准备
   

   1)

   PDA培养基灭菌后取出，室温下放置，待培养基温度约45 °C后，倒入一次性塑料培养皿中，待培养基凝固后，进行接种处理。

   2)

   从纯培养真菌平板菌落边缘用接种针挑取菌块，转移至PDA固体培养基上26 °C黑暗条件下培养14 d。

   3)

   制备终浓度为1 × 10⁶ ml^-1的孢子悬浮液。制备方法如下：取上一步骤中培养14 d的真菌，在其表面倒一层无菌生理盐水 (0.85% NaCl溶液)，用无菌毛刷轻轻刮取菌丝。以四层无菌纱布过滤并收集滤液；取滤液50 ml，沿着盖玻片边缘滴入血球计数板计数室，使用光学显微镜进行计数；用生理盐水稀释至浓度为1 × 10⁶ ml^-1的孢子悬浮液作接种剂。

   
   
   
   
2.  无菌北美枫香幼苗的培育
   
   2.1

   枫香果实成熟期为10-11月份，果穗由绿色转为黄绿色，果实采集后阴干4-7 d，然后暴晒数日，用棍打果实即可获得枫香种子 (种子在0-5 °C条件下可贮存5年左右，在-18 °C时贮存时间超过5年)。将枫香种子播种育苗床。土壤基质及其配比：泥炭土：珍珠岩：蛭石：有机肥=1：2：2：2 (121 °C高压灭菌30 min)，放置于光照培养箱，保持85%相对湿度，光照条件为14 h光照/10 h黑暗，25 °C恒温培养。
   2.2

   21 d后，当种子萌发并长成株高3-4 cm的幼苗时 (如图1所示)，从土壤基质中取出。
   
   
   图1. 北美枫香实生幼苗培育. 图为在育苗床中播种繁殖的枫香实生幼苗，实生幼苗培养条件为：25 °C恒温；85%相对湿度；14 h光照/10 h黑暗。
   
   
   2.3

   在超净工作台剪去幼苗根部，将剩余地上部分放入0.1%升汞中进行表面消毒约12 min，再用ddH₂O清洗4-5次去除表面残留升汞。
   2.4

   林木专用生根培养基——WPM培养基 (Woody Plant Medium) 灭菌后取出，室温下放置，待培养基温度约45 °C后，在超净工作台中倒入无菌试管 (25 ×240 mm) 中，待培养基凝固后，将表面消毒后的幼苗插入培养基 (如图2所示)。
   
   
   图2. 枫香幼苗生根培养示意图. 图为在装有WPM培养基的无菌试管中进行幼苗生根培养，光照培养箱内生根培养条件为25 °C恒温；14 h光照/10 h黑暗。
   
   
   2.5

   将培养有枫香实生幼苗的试管转移到光照培养箱中，25 °C恒温培养，光照条件14 h光照/10 h黑暗。待实生幼苗重新生根，苗高达到5-6 cm后，可将幼苗取出进行继代繁殖。将每一株幼苗的幼茎剪断，再次插入新的WPM培养基中进行扩繁，转移到光照培养箱中并保持同样的温度和光照条件进行继代繁殖。
   2.6

   选取根系大小、发达程度和株高较一致 (5-6 cm) 的无菌幼苗，进行共培养。
   
   
3. 实验室体系：枫香无菌幼苗-根系真菌互作体系构建
   
   3.1

   菌饼接种互作体系构建
   

   1)

   超净工作台紫外消毒后，无菌Phytatray^TMⅡ培养容器 (长宽高：11.4 cm × 8.6 cm × 10.2 cm) 中倒入70 ml改良MS培养基。

   2)

   将步骤2挑选的根系和株高较为均一的枫香无菌幼苗用镊子将轻轻取出，放入装有ddH₂O的玻璃大培养皿中，洗除幼苗根部的培养基残留，并用无菌滤纸吸干表面水份后，转接至装有改良MS培养基的Phytatray^TMⅡ无菌培养容器内。

   3)

   分为对照组和处理组，每组设置至少3个重复，每个重复包含10株无菌苗 (如图3所示)。将步骤1.1中打孔获得的菌饼随机挑取5个均匀转接至根系周围，对照组接种灭菌后的菌饼，用封口膜进行密封，防止污染。而后，转移至光照培养箱中以相同条件继续培养，根据自身实验要求设计共培养时间，然后取样进行生理指标的测定。

   
   
   3.2

   孢子悬浮液接种互作体系构建
   

   1)

   超净工作台紫外消毒后，无菌Phytatray^TMⅡ培养容器 (长宽高：11.4 cm × 8.6 cm × 10.2 cm) 中倒入70 ml改良MS培养基。

   2)

   将步骤2挑选的根系和株高较为均一的枫香无菌幼苗用镊子将轻轻取出，放入装有ddH2O的玻璃大培养皿中，洗除幼苗根部的培养基残留，并用无菌滤纸吸干表面水份后，转接至装有改良MS培养基的Phytatray^TMⅡ无菌培养容器内。

   3)

   分为对照组和处理组，每组设置至少3个重复，每个重复包含10株无菌苗 (如图3所示)。将步骤1.2中稀释获得的孢子悬浮液用移液枪吸取1 ml接种至根系周围，对照组加入0.85%无菌生理盐水1 ml。而后，转移至光照培养箱中以相同条件继续培养，根据自身实验要求设计共培养时间，然后取样进行生理指标的测定。
   
   
   图3. 枫香-真菌共培养体系示意图. 图为在装有改良MS培养基的Phytatray^TMⅡ无菌培养容器中进行枫香-真菌共培养实验 a：接种无菌PDA琼脂块作空白对照组；b：接种长满菌丝的菌块作实验处理组
   
   

   
   

溶液配方

1. PDA培养基
   马铃薯 200 g (去皮煮熟后过滤取汁液)
   葡萄糖 20 g
   琼脂 15 g
   加超纯水至1 L，调pH至7.0，121 °C高温高压灭菌15 min
2.  WPM培养基 (Woody Plant Medium)
   WPM粉末 2.78 g
   蔗糖 20 g
   琼脂粉 7 g
   IBA母液 600 μl
   加超纯水至1 L，调pH至5.8，121 °C高温高压灭菌15 min
3.  改良MS培养基
   20× 大量元素母液 25 ml
   100× 微量元素 10 ml
   100× 铁盐母液 10 ml
   100× 有机化合物 10 ml
   蔗糖 2 g
   琼脂粉 7 g
   加超纯水至1 L，调pH至5.8 ，121 °C高温高压灭菌25 min
4.  20× 大量元素母液
   NH₄NO₃ 33 g
   KNO₃ 38 g
   CaCl₂·2H₂O 8.8 g
   MgSO₄·7H₂O 7.4 g
   KH₂PO₄ 3.4 g
   加超纯水至1 L
5. 100× 微量元素母液
   KI 0.083 g
   H₃BO₃ 0.62 g
   MnSO₄·4H₂O 1.69 g
   ZnSO₄·7H²O 0.86 g
   NaMoO₄·2H₂O 0.0025 g
   CuSO₄·5H₂O 0.0025 g
   CoCl₂·6H₂O 0.0025 g
   加超纯水至1 L
6.  100× 铁盐母液
   FeSO₄·7H2O 2.78 g
   Na₂EDTA·2H₂O 3.73 g
   加超纯水至1 L
7.  100× 有机化合物母液
   肌醇 10 g
   IVB 烟酸 0.05 g
   盐酸硫胺素 0.01 g
   盐酸吡哚醇 0.05 g
   甘氨酸 0.2 g
   加超纯水至1 L
8.  IBA母液
   IBA粉末 40 mg
   溶于少量无水乙醇，吹打混匀
   加60 °C超纯水至80 ml
9. 0.1%升汞
   升汞 1 g
   溶于少量无水乙醇，吹打混匀
   加超纯水至1 L
10.  0.85%生理盐水
    NaCl 8.5 g
    加超纯水至1 L，121 °C高温高压灭菌15 min
    

致谢

本工作的顺利开展得益于国家自然科学基金青年项目 (31901290) 的经费支持。

参考文献

1. 秦媛. (2017). 盐碱地植物共生微生物资源及功能初步研究. 硕士学位论文. 中国林业科学研究院.
2. 潘雪玉. (2018). 沿海防护林树种促生、耐盐根系真菌筛选及机制初探. 硕士学位论文. 中国林业科学研究院.