结直肠癌类器官高通量药物筛选方法
High-throughput Drug Screening in Colorectal Cancer Organoids   

图文摘要

类器官高通量药物筛选流程图

材料与试剂

1. 15 ml离心管 (Gene Brick, catalog number: GP04-6500)
2. 50 ml离心管 (Gene Brick, catalog number: GP04-7500)
3. CellTiter-Glo^® 3D Cell Viability Assay (Promega, catalog number: G9683)
4. 384孔板 (Corning, catalog number: 3765)
5. Matrigel胶 (Corning-Biocoat, catalog number: 356231)
6. Advanced DMEM/F12 (Life Technologies, catalog number: 12634028)
7. HEPES (Sigma)
8. GlutaMax (Gibco, catalog number: 35050061)
9. Penicillin-Streptomycin (Gibco, catalog number: 15140163)
10. B27 supplement (Gibco, catalog number: 17504044)
11. N-Acetyl-L-cysteine (Sigma, catalog number: A9165)
12. (Leu15) Gastrin-1, human (Anaspec, catalog number: AS-64149)
13. Human EGF (Pepro Tech, catalog number: AF-100-15-500)
14. Human Noggin (Novoprotein, catalog number: CB89)
15. 10% R-Spondin1 conditional medium
16. A83-01 (Tocris, catalog number: 2939)
17. Nicotinamide (MCE, catalog number: HY-B0150)
18. Prostaglandin E2 (MCE, catalog number: HY-101952)
19. Primocin (InvivoGen, catalog number: ant-pm-1)
20. TrypLE^TM Express (Thermofisher-Invitrogen, catalog number: 12604013)
21. Countess^TM细胞计数腔室载玻片 (Thermofisher, catalog number: C10228)
22. T8+ Dispensehead Cassettes (Tecan, catalog number: 30097370)
23. 84消毒液 (江苏爱特福, catalog number: LB1250)
24. PDO培养基 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 4 °C离心机 (Eppendorf, model: 5810R)
2. Multidrop自动分液器 (Thermofisher, model: Multidrop Combi)
3. Envision多标记微孔板检测仪 (PE, model: Envision)
4. 非接触式数码滴定仪 (Tecan, model: D300e)
5. Countess II FL全自动细胞计数仪 (Thermofisher, catalog number: AMQAX1000)
6. 37 °C水浴锅 (上海精宏, catalog number: DK-420)
7. 细胞培养箱 (Thermofisher, model: 3111)
8. TS-8转移摇床调速 (其林贝尔, model: TS-8)
9. 荧光显微镜 (Olympus)
   

实验步骤

本实验方法可以同时检测多株PDO对于多种药物的敏感性，在此以检测某药物对于一株PDO的半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC₅₀)为例(实际操作时药物数量以及PDO数量依实验需求而定)，详细步骤如下：

一、384孔板预铺Matrigel胶(仪器：Multidrop自动分液器，离心机)

1. 准备Matrigel悬液，将Matrigel用预冷的PDO培养基稀释为约50%的Matrigel悬液(需无菌操作)，放置于冰上即可，同时准备6管50 ml预冷的Milli-Q水，2管50 ml 的10% 84消毒液(用Milli-Q水进行稀释)。
2. 打开Multidrop自动分液器，选择合适的分液管以及管道，以Standard tubes举例。
   
3. 注释：如果体积较小，可以选用Small tubes分液管，依据实验需要而定。
4. 设置参数：孔板类型：384孔板，管道类型：Standard tubes，分液体积：10 µl，加样位置：以实际需求为准(共1-24可选)。
5. 将Multidrop分液管浸泡在10% 84消毒液中5-10 min，随后用消毒液冲洗管道，然后用Milli-Q水冲洗管道3次。
6. 注释：在一管溶液冲洗完毕之后，将管道内部残余液体排出，然后用下一管溶液进行冲洗。
7. 将Multidrop的分液管放置于Matrigel悬液中，将孔板开盖放置于仪器上，进行加样。
8. 注释：在分液的时候，室温即可，无需保持4 °C环境。
9. 将孔板在150 × g的离心力条件下于室温离心2 min，之后将384孔板放置于37 ℃培养箱内1 h左右使Matrigel聚合。
10. 注释：若1 h后Matrigel未聚合，可能是由于Matrigel浓度较低，将384孔板于37 °C培养箱继续放置一段时间即可。
11. 对Multidrop的分液管依次用10% 84消毒液、Milli-Q水冲洗，关闭机器，将分液管卸下。
    

二、制备并分装类器官细胞悬液(仪器：显微镜，Countess II FL全自动细胞计数仪，Multidrop自动分液器，离心机)

1. 用移液器直接将培养PDO的Matrigel吹破，将PDO和Matrigel从24孔板中转移至15 ml管中，用预冷的Advanced DMEM/F12培养基清洗细胞2次以去除Matrigel，离心参数：300 × g，4 °C，5 min。
2. 用1-2 ml TrypLE^TM Express消化液重悬，37 °C水浴锅孵育2-10 min。
3. 取10 µl的细胞悬液于显微镜下镜检，>80%细胞消化成单细胞即可(如图1)。
4. 将细胞悬液离心300 × g，4 °C离心5 min。
5. 用Advanced DMEM/F12培养基清洗细胞2次，离心步骤同4。
6. 将细胞用含5%的Matrigel的PDO培养基重悬，利用细胞计数仪进行计数，最终得到合适细胞密度(45 × 10³ - 90× 10³ cells/ml)的悬液。
   
   
   图 1. PDO消化前后代表性图像. 左侧为PDO代表性图像，无需消化即可观察到各种大小的organoid，右侧为PDO消化后的图像。Scale bar，200 μm。
   
   
7. 利用Multidrop自动分液器将细胞铺至预铺好Matrigel的384孔板内，每孔体积45 µl左右为宜(接种细胞数目为2k - 4k/well)。
8. 将孔板在150 × g的离心力条件下于室温离心2 min，然后将其放置于37 °C培养箱过夜。
   

三、药物处理(仪器：非接触式数码滴定仪，离心机)

1. 设置合适的药物浓度梯度，(例如，最高浓度为30 µM，然后以2倍稀释法稀释至7 nM)。
2. 利用D300e设置每一个孔的药物浓度，然后选用最高浓度进行Normalize操作(Normalize方法有多种，按照实际需要即可)。
3. 按照D300e仪器操作提示进行操作即可(放置芯片-将对照以及药物加在对应的孔内-开盖-加样)。
4. 将孔板在150 × g的离心力条件下于室温离心2 min，之后将孔板放置于37 °C培养箱培养6天。
   

四、细胞活力检测(仪器：Envision多标记微孔板检测仪，离心机，TS-8转移摇床调速，Multidrop自动分液器)

1. 将CellTiter-GLO试剂解冻，按照说明书计算所需要的溶液量。
2. 利用Multidrop自动分液器将CellTiter-GLO试剂加至孔板内，将孔板在150 × g的离心力条件下于室温离心2 min，室温震荡孵育20 min。
3. 利用Envision多标记微孔板检测仪检测荧光读值。
4. 将数据输入GraphPad Prism 7中，利用Log(inhibitor) vs. response — Variable slope(four parameters)拟合出IC₅₀。
   

注意事项

1. Milli-Q水需要提前进行灭菌，由于Matrigel特性，Milli-Q水必须预冷。
2. 在分液的时候prime键不能过久长按，否则会加快对机器的损耗。
3. 在消化PDO的时候，应确保至少80%的细胞为单细胞状态，但时间又不能过久，否则细胞状态会变差。
4. 在进行药物筛选试验的时候，细胞状态很重要，最好选用新复苏的PDO进行药物筛选试验。
5. 在利用D300e加药的时候避光，否则可能影响药物效果。
6. 在使用CellTiter-GLO试剂的时候，避免反复冻融。
7. 在遇到Multidrop堵塞的时候，用注射器进行反冲，将杂物冲出即可。
   

结果与分析

图 2. 药物作用的量-效关系曲线

由图2可知，该药物对于该PDO的半数抑制浓度(IC₅₀)约为96.8 nM。HillSlope越靠近-1，R square越接近于1，则得到的IC₅₀值越准确。本实验每一个浓度设置2个复孔，为了得到比较准确的数据，可以设置多个复孔，并需要2 - 3次试验重复。

溶液配方

PDO培养基
Advanced DMEM/F12, 1× Penicillin-Streptomycin, 1× GlutaMax, 10 mM HEPES, 1× B27, 10 nM Gastrin, 1 µM N-Acetyl-L-cysteine, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 10% R-Spondin1 conditional medium, 0.5 µM A83-01, 10 mM Nicotinamide, 1 µM Prostaglandin E2, 100 µg/ml Primocin.

致谢

该项研究得到了国家自然科学基金委的资助。该研究数据收集工作得到了中国科学院分子细胞科学卓越创新中心化学生物学技术平台的大力支持。

参考文献

1. Roerink, S. F., Sasaki, N., Lee-Six, H., Young, M. D., Alexandrov, L. B., Behjati, S., Mitchell, T. J., Grossmann, S., Lightfoot, H., Egan, D. A., et al. (2018). Intra-tumour diversification in colorectal cancer at the single-cell level. Nature 556(7702): 457-462.
2. van de Wetering, M., Francies, H. E., Francis, J. M., Bounova, G., Iorio, F., Pronk, A., van Houdt, W., van Gorp, J., Taylor-Weiner, A., Kester, L., et al. (2015). Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell 161(4): 933-945.
3. Verissimo, C. S., Overmeer, R. M., Ponsioen, B., Drost, J., Mertens, S., Verlaan-Klink, I., Gerwen, B. V., van der Ven, M., Wetering, M. V., Egan, D. A., et al. (2016). Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening. Elife 5.
4. Vlachogiannis, G., Hedayat, S., Vatsiou, A., Jamin, Y., Fernandez-Mateos, J., Khan, K., Lampis, A., Eason, K., Huntingford, I., Burke, R., et al. (2018). Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science 359(6378): 920-926.