基于三维多细胞肿瘤球体模型的药动-药效评价
The Pharmacokinetics-Pharmacodynamics Evaluation Based on Three-dimensional Multicellular Tumor Spheroid   

材料与试剂

一、材料

1. 移液器：10 μL（Eppendorf Research^®, catalog number: 3120000224）；200 μL （Eppendorf Research^®, catalog number: 3120000259）；1 mL （Eppendorf Research^®,catalog number: 3120000267）；
2.  枪头：10 μL（Axygen^®, catalog number: AXYT300）；200 μL （Axygen^®, catalog number: AXYT200Y）；1 mL （Axygen^®, catalog number: AXYT1000B）；
3. 离心管：15 mL（Axygen^®, catalog number: AXYSCT15ML25S）；1.5 mL （Axygen^®, catalog number: AXYMCT150C）；
4. 移液管（Corning^®, catalog number: CLS4488）；
5. 细胞培养瓶（Corning^®, catalog number: CLS430168）；
   
6. 96孔细胞低吸附U底板（SUMILON PrimeSurface^TM, catalog number: MS-9096UZ）。

二、试剂

1. 胎牛血清（Gibco^® 10091-148）；
2. 无血清培养基（根据细胞种类，选择相应培养基）；
   注1：“结果与分析”项中涉及的HepG2人肝癌细胞株用DMEM培养基 （Gibco^® , catalog number: 10313-021），MCF-7人乳腺癌细胞株用RPMI1640培养基 （Gibco^®, catalog number: A10491-01）。
   
3. 细胞培养用抗生素（10,000 U/ mL 青霉素与链霉素, Gibco^®, catalog number: A15140-122）；
4. PBS缓冲液（碧云天, catalog number: ST447）；
5. 2% 异戊二醛（Sigma-Aldrich, catalog number: 354400）；
6. Cell Counting Kit-8（CCK-8）检测试剂 （碧云天, catalog number: C0039）；
7. 0.25% 胰蛋白酶溶液（Merck, catalog number: 59428C）；（Merck, catalog number: 59428C）；
8. RPMI1640完全培养基（见溶液配方）；
9. DMEM完全培养基（见溶液配方）。

仪器设备

1. 高压灭菌锅（HITACHI SX-700）；
2. 生物安全柜（Thermo Fisher Scientific 1384）；
3. Lionheart™ FX 智能活细胞成像分析系统（BioTek）；
4. 二氧化碳培养箱（Thermo Fisher Scientific 3111）；
5. 离心机（Eppendorf^® Centrifuge Mini Spin）。
   

实验步骤

一、三维多细胞肿瘤球体模型（MCTS）的培养

1. 培养密度的筛选
   将消化好的细胞按照1,000、2,500、5,000、7,500、10,000、15,000 个/孔的密度接种于细胞低吸附处理产品PrimeSurface^TM 96 U型板，晃动混匀后，放置于培养箱。72 h后隔天对半换液。Lionheart^TM FX 智能活细胞成像分析系统实时监测不同接种密度下，MCTS的圆度、直径、面积、透光率及相对体积随时间变化规律，考察最优细胞接种密度。
   
2. 培养时间的筛选
   确定细胞密度后，通过扫描电镜考察不同培养时间下MCTS的立体结构及生理状态。以最优密度接种细胞，收集培养5、8、11、14天的MCTS。一部分直接固定于2 % 异戊二醛，扫描电镜检测MCTS的三维立体形态；另一部分在显微镜下用手术刀片沿中轴线切开后固定，检测时选取各样本中垂直摆放的MCTS，观察不同培养天数下，MCTS的内部细胞及外部细胞的生理状态。以MCTS外周细胞状态良好 （细胞膜完整且细胞饱满）而中心细胞呈调亡坏死状态（细胞膜破损且细胞皱缩）为标准，确定适宜的培养时间。
   

二、基于三维多细胞肿瘤球体模型的药效评价

1. 待测药物配制
   配制一系列浓度的储备液（1000x），于无菌环境下用无血清培养基稀释至目标给药浓度。
   
2. 给药
   用200 μL枪头将96孔板中的培养基吸取干净，弃掉原有培养基后，加入200 μL含药培养基。
   注2：将96孔板一边微微抬起，呈一定角度面朝实验者侧放，200 μL枪头小心吸取培养基，且注意不碰触MCTS。可通过肉眼观察孔底是否留有MCTS或者吸取液体内是否带有MCTS，判断操作是否准确。
   注3：考虑到后续实验MCTS可能因操作遗失，在给药时，每个浓度一般设置大于8个复孔（n > 8）。
   
3. CCK-8法检测
   达到给药时间终点后，用200 μL枪头小心吸弃含药培养基。每孔加入90 μL无酚红无血清的培养基以及10 μL CCK-8反应溶液，轻摇混合均匀。同时在空白无细胞孔中加入相同溶液，设置空白对照，检测CCK-8反应溶液本底。于37 °C避光反应一定时间后，于450 nm波长处测定吸光度值（A）。
   细胞生长抑制率计算公式如下：
   
   注4：在三维多细胞肿瘤球体模型实验中，CCK-8反应时间一般为2 h。当对照不给药组吸光度小于0.8时，可于37 °C继续避光孵育，适当延长CCK-8的反应时间。
   

三、基于三维多细胞肿瘤球体模型的摄取动力学评价

1. MCTS的富集
   考虑到单个MCTS内药物含量无法达到常规药物浓度检测方法（LC-MS/MS等）的检测下限，基于MCTS的摄取动力学评价将6个MCTS体富集为一个样本。用1 mL枪头将6个MCTS逐一吸取至无菌1.5 mL离心管，待用。可根据给药方案，准备所需的富集样本。
   
2. 给药
   用200 μL枪头小心吸弃1.5 mL离心管中的培养基，加入0.5 mL含药培养基。盖紧管盖后，食指指腹轻轻敲打1.5 mL离心管数次，使MCTS从管底悬浮起来，勿过于用力破坏MCTS结构。而后放入37 °C细胞孵育箱中孵育。
   
3. 终止实验
   达到给药终点后，800 × g离心，使MCTS沉落于1.5 mL离心管底部，200 μL枪头小心吸弃含药培养基。加入4 °C PBS 1 mL，食指指腹轻轻敲打1.5 mL离心管数次，使MCTS从管底悬浮起来，荡洗管壁和MCTS表面残留的含药培养基。 800 × g离心，使MCTS沉落于1.5 mL离心管底部，200 μL枪头小心吸弃PBS。根据后续药物检测需求处理样本，或将样本冻于-80 °C待用。
   

结果与分析

一、基于HepG2 MCTS评价常用小分子药物阿霉素（DOX）和紫杉醇（PTX）的药动-药效行为。（Liu et al., 2017）

1. HepG2 MCTS的构建与验证
   考察不同接种密度、不同培养时间下，HepG2细胞的成球情况，筛选构建MCTS的最适培养条件并对其生理生化状态进行验证。
   首先，我们考察了不同的细胞接种密度对MCTS成球能力的影响。如图1（A）所示，以2.5x10³个/孔的密度接种，MCTS的圆度不佳；以5x10³个/孔的密度接种，MCTS的相对厚度不佳；当接种密度达到7.5x10³个/孔及以上时，各接种密度下MCTS的圆度及相对厚度并无明显差异。考虑到相同厚度的情况下，以7.5x10³个/孔接种的MCTS的直径和平面面积明显小于以10x10³或15x10³ 个/孔接种的MCTS，平均相对圆度维持在0.9以上，三维立体结构更趋向于球形，因此后续实验选取7.5x10³ 个/孔作为最适接种密度。之后，我们对培养时间进行了筛选， 如图1（B）所示，培养8天时MCTS外层细胞状态良好，而培养时间延长至13天或18天时，外周区域细胞会出现融合增多、表面绒毛减少的损伤现象，MCTS总体状态不佳。因此，实验选取7.5 x 10³ 个/孔，培养7-8天作为HepG2成球的最适条件。该培养条件下，可形成直径为500 µm的HepG2 MCTS（图1（C）），且立体结构良好（图1（D））。HE染色及Ki67免疫组化结果 （图1（E）） 显示培养所得HepG2 MCTS外周区域细胞增殖旺盛、生理状态良好；而中心区域细胞增殖能力下降、出现凋亡、坏死的现象，具有和在体肿瘤组织相似的生理状态。
   
   
   图 1. HepG2 MCTS的构建与验证。（A）以不同密度接种HepG2细胞，实时观察不同接种密度下，相对圆度、相对厚度、相对直径、相对面积和相对体积随培养时间的变化规律；（B）沿中轴线切割MCTS后，通过扫描电镜检测MCTS内部及外周区域细胞的生理状态；7500个HepG2细胞培养7天后，分别用明场显微镜（C）和扫描电镜（D）观察HepG2 MCTS的平面及三维形态。 （E）MCTS和肿瘤切片的H&E染色和Ki67染色。数据以平均值（mean）± 标准误（SEM）表示。
   
   
2. DOX和PTX在HepG2 MCTS的药动-药效行为
   当HepG2细胞由二维 （单层细胞，SLC）向三维（细胞球，MCTS）转化后，其对抗肿瘤药物DOX和PTX的敏感度显著下降。DOX在SLC的IC₅₀值为0.703 µM，而在MCTS的IC₅₀值为9.714 µM（图2（A））；PTX在SLC的IC₅₀值为0.022 µM，而在MCTS的IC₅₀值为0.136 µM（图2（B））。
   与药效结果一致，MCTS对DOX、PTX的摄取速率及程度显著低于SLC（图2（C-D））。相同给药剂量下，DOX在SLC的饱和累积量为9.013 ± 0.4413 nmole/mg protein而在MCTS的饱和累积量为3.505 ± 0.3833 nmole/mg protein，两者相差2.57倍。对于PTX而言，其在SLC的饱和累积量为1.005 ± 0.0165 nmole/mg protein，而在MCTS的饱和累积量则为 0.5794 ± 0.0163 nmole/mg protein，两者相差1.73倍。
   
   
   图 2. DOX和PTX在HepG2 MCTS的药动-药效行为。给予不同浓度DOX（A，单层细胞模型的给药浓度为 0.25、0.5、0.75、1.0、2.0、5.0、10.0 µM；多细胞球体模型的给药浓度为2、5、10、20、30、40、50、60、70 µM）或PTX（B，单层细胞模型的给药浓度为0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 µM；多细胞球体模型的给药浓度为 0.05、0.1、0.2、0.5、2.5、5、10、25、50 µM），给药72 h 后，CCK-8法检测SLC和MCTS的细胞存活率。分别给予10 µM DOX（C）或5 µM PTX（D），于给药 1、2、4、8、16、24 h，LC-MS/MS检测SLC和MCTS内的药物浓度。数据以平均值（mean）± 标准误（SEM）表示。
   
   

二、基于MCF-7 MCTS评价人参皂苷Rh2对阿霉素（DOX）药动-药效行为的影响。（Liu et al., 2020）

1. MCF-7 MCTS的构建与验证
   参照“结果与分析” 项一（1）的筛选方法，最终确定以5 x 10³个/孔接种MCF-7细胞，培养8天，可得三维形态良好、和肿瘤组织生理状态相似的MCF-7 MCTS （图3）。
   
   
   图 3. MCF-7 MCTS的构建与验证。以5 x 10³个/孔的密度接种MCF-7细胞，实时观察MCTS形态（A），以及相对圆度、相对厚度、相对直径、相对面积和相对体积（B）随培养时间的变化规律；用5 x 10³个HepG2细胞培养8天后，通过HE染色（C）和扫描电镜（D）考察MCF-7 MCTS内部及外周区域细胞的生理状态。数据以平均值（mean）± 标准误（SEM）表示。
   
   
2. 预给予Rh2增加DOX在MCF-7 MCTS的细胞毒作用及胞内累积量
   预给予Rh2不同时间（24 h、48 h和72 h）可显著增强MCTS对DOX的敏感性及 摄取能力。随着Rh2预处理时间的增加，DOX在MCTS的半数抑制浓度（IC₅₀）逐渐降低，在细胞内的积累量逐渐增加（图4）。
   
   
   图 4. Rh2对DOX在MCF-7 MCTS的药动-药效行为的影响。（A）预给予5 µM Rh2不同时间（24、48、72h）后，撤去Rh2，再给予不同浓度DOX（0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300 µM）72h，CCK-8法检测不同给药方案对MCF-7 MCTS的生长抑制作用；（B）不同给药方案在MCT-7 MCTS模型上的半数抑制浓度；（C）预给予5 µM Rh2不同时间（24、48、72h）后，撤去Rh2，再给予10µM DOX，于1、4、8、16、24 h后，LC-MS/MS检测MCF-7 MCTS内DOX的浓度，并计算胞内药物浓度-时间曲线的曲线下面积（Area Under Curve，AUC）。数据以平均值（mean）± 标准误（SEM）表示， 与单用DOX组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
   
   

溶液配方

1. RPMI1640完全培养基
   市售无血清RPMI1640培养基 + 10%胎牛血清 + 抗生素（100 U/mL）
   无菌环境配制，4 °C冷藏，注意密封，1个月内使用；
   
2. DMEM完全培养基
   市售无血清DMEM高糖培养基 + 10%胎牛血清 + 抗生素 （100 U/mL)
   无菌环境配制，4 °C冷藏，注意密封，1个月内使用。
   

致谢

感谢国家自然科学基金青年项目（81803625）和江苏省自然科学基金青年项目（BK20180558）的资助。

参考文献

1. Liu, J., Cai, Q., Wang, W., Lu, M., Liu, J., Zhou, F., Sun, M., Wang, G. and Zhang, J. (2020). Ginsenoside Rh2 pretreatment and withdrawal reactivated the pentose phosphate pathway to ameliorate intracellular redox disturbance and promoted intratumoral penetration of adriamycin. Redox Biol 32: 101452.
2. Wang, W., Cai, Q., Zhou, F., Liu, J., Jin, X., Ni, P., Lu, M., Wang, G. and Zhang, J. (2018). Impaired pentose phosphate pathway in the development of 3D MCF-7 cells mediated intracellular redox disturbance and multi-cellular resistance without drug induction. Redox Biol 15: 253-265.
3. Liu, J., Yan, F., Chen, H., Wang, W., Liu, W., Hao, K., Wang, G., Zhou, F. and Zhang, J. (2017). A novel individual-cell-based mathematical model based on multicellular tumour spheroids for evaluating doxorubicin-related delivery in avascular regions. Br J Pharmacol 174(17): 2862-2879.