利用高内涵筛选系统进行线粒体膜电位检测 (TMRM染色)
Mitochondrial Transmembrane Potential (ΔΨm) Detection Using High Content Screening System   

材料与试剂

1. 96 Well Black Assay Plate, Clear Bottom with Lid, 3603 (Corning Costar, Cambridge, MA, catalog number: 04119005)
2. HepG2细胞 (ATCC, USA)
3. Opti-MEM (Gibco，catalog number: 11058021)
4. Lipofectamine® RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA, catalog number: 13778075)
5. miRNA mimics (上海吉玛制药技术有限公司)
6. MEM/EBSS培养基 (Hyclone, Logan, UT, USA，catalog number: AF29549370)
7. Penicillin/Streptomycin (Gibco, Germany，catalog number: 15240-062)
8. 四甲基罗丹明甲酯TMRM (Sigma, catalog number: T5428)
9. CCCP (Sigma, catalog number: C2759)
10. Hoechst 33342 (上海翌圣生物科技有限公司，Yeason，catalog number: 40731ES10)
11. 20x PBS (上海生工生物工程有限公司，catalog number: B548117)
12. DMSO (Sigma, catalog number: BCBZ1685)
    
13. 棕榈酸钠Sodium palmitate (Sigma, catalog number: P9767)
14. BSA，Fatty Acid Free牛血清白蛋白 (上海翌圣生物科技有限公司，Yeason，catalog number: 9048-46-8)
15. 200 μM TMRM (见溶液配方)
16. 1 mM CCCP (见溶液配方)
17. 10 mg/ml Hoechst 33342储存液 (见溶液配方)
18. MEM/EBSS完全培养基 (见溶液配方)
19. 1x PBS (见溶液配方)
20. 10 mM PA (见溶液配方)
21. 9% BSA (见溶液配方)
    

仪器设备

1. PerkinElmer Operetta CLSTM (PerkinElmer, USA)
2. 移液器 (Eppendorf)
   

实验步骤

1. 转染与铺细胞
   1)

   对于96孔板的每一个转染孔，将0.25 μl 的Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂加入25 μl Opti-MEM减血清培养基中进行稀释配成转染试剂混合液，轻轻吹打混匀，室温放置5 min。
   2)

   在上述转染试剂混合液中加入合成的miRNA mimics使其终浓度为30 nM, 轻轻吹打混匀，室温温育20 min，加入96孔板中。
   3)

   从培养箱中取出HepG2细胞，吸去培养液，用无菌的PBS洗涤细胞一次，以去除残余的血清，加入含 EDTA 的胰酶并放入细胞培养箱中消化3 min。
   4)

   用含有10% FBS的完全MEM/EBSS培养基终止消化， 1000 rpm, 离心3 min。
   5)

   弃去上清，细胞沉淀用2 ml 完全MEM/EBSS培养基重悬并进行细胞计数。
   6)

   将细胞密度稀释为1 x 10⁵ 个/ ml并铺在96孔板中 (100 μl/孔)，同时预留1列细胞进行CCCP处理，将细胞放于37 °C培养箱中培养。
2. 药物处理
   1)

   细胞贴壁培养48 h后，用完全MEM/EBSS培养基稀释10 mM PA母液至终浓度为0.2 mM，同时稀释9% BSA母液作为对照。
   2)

   将96孔板取出，吸去培养基，分别加入配制好的含有PA及BSA的培养基 (各3复孔)，继续放回培养箱中培养。
   3)

   药物处理24 h后，在MEM/EBSS完全培养基中1:1000稀释CCCP (终浓度为10 μM) , 加入预留的细胞孔中 (DMSO作为对照)，37 °C孵育30 min。
3. TMRM染色
   1)

   30min后，取出96孔板，吸去培养基，加入含有TMRM (终浓度为100 nM)，Hoechst (终浓度2 μg/ml) 的MEM/EBSS完全培养基，37 °C孵育30 min。
   2)

   30 min后，取出96孔板，吸去含有染料的培养基，避光条件下用PBS洗3次。
4. 高内涵成像
   1)

   依次打开Operetta主机，Harmony4.9 软件，将96孔板放入仪器中，设置图像采集条件 (孔板型号及物镜倍镜)，添加所需的荧光通道 (TMRM：549 nm激发波长; 573 nm发射波长；Hoechst 33342：360 nm激发波长; 460 nm发射波长)。
   2)

   调整time (曝光时间)，power (光源强度) 及height (聚焦高度)。
   3)

   选择要拍摄的孔和视野，点击Run Experiment进行图像采集。
   4)

   拍摄完成后，点击Image Analysis进行图像分析，依次点击Find Nuclei，Find cytoplasm，然后点击calculate intensity properties选择荧光强度计算的范围 (细胞浆)，最后通过select population功能，筛选阳性细胞并输出结果。
   5)

   点击Evaluation进行多孔分析。
   6)

   最后，点击Data management输出数据。
   
   

结果与分析

首先在HepG2细胞给予不同浓度的PA (0.05 mM，0.1 mM，0.2 mM，0.5 mM) 处理24 h，摸索导致膜电位损伤的合适浓度。结果表明，CCCP处理30 min可明显降低TMRM荧光强度，导致线粒体膜电位损伤 (图1 A)。不同浓度PA也可导致膜电位降低，但0.5 mM PA处理条件下，细胞死亡较多，造成的线粒体损伤较严重，miRNA mimics可能无法有效逆转该损伤，故选用0.2 mM PA作为诱导膜电位损伤的条件进行高内涵筛选 (图1 B)。


图 1. PerkinElmer Operetta CLSTM 采集荧光信号 A. 阳性对照CCCP处理HepG2细胞，TMRM荧光图及荧光强度定量；B. 不同浓度PA处理HepG2细胞，TMRM荧光图及荧光强度定量。

失败经验

1. 由于将Hoechst与TMRM共孵育30 min，所以Hoechst的浓度不能过高，否则会导致细胞核过曝，影响统计结果。
2. 用PBS洗去剩余染料时，应该动作尽量轻，否则会导致细胞被吹起，影响实验结果。
3. TMRM及Hoechst染色时，可能会存在杂质及死细胞等的异常染色，因此在分析荧光强度时可以在"filter by property"方法下通过设定intensity范围来筛选阳性细胞，排除阴性结果。
   

溶液配方

1. 200 μM TMRM：用DMSO溶解配成200 μM母液，-20 °C避光保存。
2. 10 mM CCCP：用DMSO溶解配成10 mM母液，-20 °C避光保存，配置成母液后尽量在一个月内使用。
3. Hoechst 33342储存液：用无菌超纯水溶解配制10 mg/ml Hoechst 33342的储存液，-20 °C避光保存。
4. MEM/EBSS完全培养基：
   MEM/EBSS培养基 450 ml
   FBS 50 ml
   Penicillin/Streptomycin 5 ml
   
5. 1x PBS：
   取50 ml 20x PBS加入ddH₂O并定容至1 L，高压蒸汽灭菌，冷却后室温保存。
   
6. 10 mM PA：
   称取27.841 mg 棕榈酸钠 (Sodium palmitate)，加入1 ml PBS中，70 °C加热溶解成100 mM的母液；称取2 g不含脂肪酸的BSA溶解于20 ml PBS中，55 °C加热；将 1 ml PA母液加入9 ml BSA中，55 °C加热至溶液澄清即得到10 mM PA，冻存于-20 °C，使用时用培养基稀释至所需浓度。
   

致谢

感谢中国科学院上海药物研究所李佳老师课题组对该实验方法的PerkinElmer Operetta CLSTM仪器设备的支持。基金项目 (Foundation)：国家科技部"重大新药创制"科技重大专项 (No 2018ZX09101001-003-007)。

参考文献

1. Creed, S. and McKenzie, M. (2019). Measurement of mitochondrial membrane potential with the fluorescent dye tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM). In: Haznadar M. (Ed.). In: Methods in molecular biology. Humana Press, New York, NY. ISBN: 9781493990276.
2. Jun, D. W., Cho, W. K., Jun, J. H., Kwon, H. J., Jang, K. S., Kim, H. J., Jeon, H. J. , Lee, K. N., Lee, H. L., Lee, O. Y., Yoon, B. C., Choi, H. S., Hahm, J. S. and Lee, M. H. (2011). Prevention of free fatty acid-induced hepatic lipotoxicity by carnitine via reversal of mitochondrial dysfunction. Liver Int 31(9): 1315-1324.
3. Massey, A. J. (2015). Multiparametric cell cycle analysis using the operetta high-content imager and harmony software with PhenoLOGIC. PLoS One 10(7): e0134306.