果蝇肠上皮损伤再生模型实验方法
A Method for Damage-induced Regeneration of the Intestinal Epithelium in Drosophila   

材料与试剂

1. 色谱层析滤纸 (chromatography paper, Fisher, Code: 69)
2. 载玻片 (Fan Yi, catalog number: 7105P)
3. 盖玻片 (Henso, catalog number: 7201)
4. 培养瓶 (BIOLOGIX, catalog number: 51-0500)
5. EP管 (美国AXYGEN公司，catalog number：MCT-200-C)
6. 3~5天的雌果蝇
7. DSS (36,000~50,000 M.Wt., MP Biomedicals, catalog number: 9011-18-1)
8. 葡萄糖 (Sigma-Aldrich, catalog number: S7903)
9. 实验用抗体：
   Anti-Prospero(DSHB，MR1A)
   Goat anti-mouse IgG conjugated to Alexa 568 (Molecular Probes, catalog number: A11036)
10. 酵母 (英国OXOID公司，catalog number：LP0021)
11. PBS (Solarbio, catalog number: P1020)
12. DAPI (Sigma-Aldrich, catalog number: D9542)
13. 37%多聚甲醛 (Sigma-Aldrich, catalog number: F1635)
14. 正庚烷 (国药集团化学试剂有限公司，catalog number: 80066918)
15. 甲醇 (北京化工厂，catalog number：B0301005)
16. 羊血清 (NGS, Cell Signaling Technology, catalog number: 5425)
17. Triton X-100 (Sigma-Aldrich, catalog number: T9248)
18. 5% DSS溶液 (见溶液配方)
19. 5%葡萄糖溶液 (见溶液配方)
20. 封片溶液 (见溶液配方)
21. PBT溶液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 电子天平 (无锡英衡电子有限公司)
2. 移液枪 (法国GILSON PIPETMAN)
3. 镊子 (瑞士Dumont公司)
4. 摇床 (上海智城分析仪器制造有限公司)
5. 通风橱 (北京中联科仪科技有限公司)
6. 4 °C冰箱 (中国海尔集团)
7. 显微镜 (Nikon A1-R confocal microscope)
   

实验步骤

1. 挑选3~5天的雌果蝇，将已经用水湿润的滤纸放入培养瓶中，饥饿处理10小时。
2. 对照组果蝇空管中滴加500 µl 5%的葡萄糖溶液的色谱层析滤纸 (大小为2.5 cm × 3.75 cm)；实验组果蝇管中滴加500 µl 5% DSS和500 µl 5%葡萄糖溶液的滤纸 (大小为2.5 cm × 3.75 cm)，果蝇每天换管和相对应新的滴有溶液的色谱层析滤纸，于29 °C下处理两天。
3. 两天后，将果蝇转移到正常食物管中培养，添加少许酵母，培养7~14天。
4. 取400 µl PBS溶液于EP管中。
5. 用镊子将肠道取出放入EP管中。果蝇肠道详细解剖步骤见Chen等 (2016a) 发表的论文。
6. 在EP管中加入60 µl 37%甲醛和500 µl 100%正庚烷，在摇床上避光30分钟。
7. 在通风橱中弃掉全部液体。
8. 在EP管中加入500 µl 100%甲醇和500 µl 100%正庚烷，用手剧烈摇晃30秒。
9. 在通风橱中弃掉全部液体。
10. 在EP管中加入1 ml 100%甲醇，在摇床上避光5分钟。
11. 弃掉全部液体，重复步骤10一次。
12. 用1 ml PBT洗涤两次，每次5分钟。
13. 封闭：在EP管中加入300 µl PBT和15 µl normal goat serum于摇床上避光60分钟。
14. 染一抗：在EP管中直接加入一抗，于4 °C摇床上避光过夜。
15. 弃掉全部液体，用1 ml PBT洗涤三次，每次5分钟。
16. 染二抗：在EP管中直接加入300 µl PBT和1 µl二抗，在摇床上避光2小时。
17. 弃掉全部液体，用1 ml PBT洗涤2次，每次5分钟。
18. 在EP管中加入300 µl PBT和1 µl DAPI于摇床上反应5分钟。
19. 用1 ml PBT洗涤两次，每次5分钟。
20. 加两滴封片溶液于EP管中，于4 °C冰箱中保存20分钟。
21. 制片，在显微镜下观察。
    

结果与分析

本实验方法参考Amcheslavsky等 (2009) 和Chen等 (2016b) 发表的论文。果蝇肠道是由平滑肌围裹的单层管状上皮结构构成。果蝇的肠腔由内到外分别为围食膜、肠上皮层、基底膜和平滑肌层。肠道细胞中的多功能肠道干细胞 (intestinal stem cells，ISCs)通过有丝分裂产生新的干细胞和子代细胞,称之为肠母细胞或中间过渡型细胞 (enteroblast，EB)。EB细胞进一步分化成具有营养吸收功能的肠上皮细胞 (enterocytes，ECs) 和肠内分泌细胞 (enteroendocrine cell，EE)，两者分别由Pdm1和Prospero蛋白标记。EC细胞占肠道总细胞数量的90%，是多倍体细胞，具有较大的细胞核。ISC和EB细胞 (统称为前体细胞) 以及EE细胞为二倍体，具有较小的细胞核。
       DSS处理的果蝇后两天与对照组比较能观察到esg (esgGal4, UAS-GFP) 表达的细胞 (ISC和EB) 增多，显微镜下GFP阳性细胞相对数量会显著增多 (图1)。


图1. DSS处理的果蝇肠道ISC和EB细胞增多

注意事项

1. 实验用DSS的分子量比较关键，根据我们的经验40 KDa的效果比较好。
2. 5% DSS处理的两天一般为损伤期，处理后1~2天一般为恢复期。
3. 根据我们的经验，5% DSS处理两天后果蝇死亡率大概为10%。
4. 由于肠道中各区段干细胞的活性不一，DSS处理后的不同区段的反应程度也会有差异。

溶液配方

1. 5% DSS溶液
   溶解100 mg DSS于2 ml无菌的水中，使用前溶液保存在4 °C，最好现配现用
   
2. 5%葡萄糖溶液
   溶解100 mg葡萄糖于2 ml无菌的水中，使用前溶液保存在4 °C，最好现配现用
   
3. 封片溶液
   用甘油和1× PBS溶液体积比7:3配成
   
4. PBT溶液
   在100 ml 1× PBS中加入0.1 ml Triton X-100混匀
   

致谢

感谢金真为本文提供图片。

参考文献

1. Amcheslavsky, A., Jiang, J. and Ip, Y. T. (2009). Tissue damage-induced intestinal stem cell division in Drosophila. Cell Stem Cell 4(1): 49-61.
2. Chen, J., Li, J., Huang, H. and Xi, R. (2016a). Gene expression analysis of sorted cells by RNAseq in Drosophila intestine. Bio-protocol 6(24): e2079.
3. Chen, J., Xu, N., Huang, H., Cai, T. and Xi, R. (2016b). A feedback amplification loop between stem cells and their progeny promotes tissue regeneration and tumorigenesis. Elife 5: e14330.