材料和试剂

荧光微珠（例如 FluoSpheres0.5μm）（Life Technologies，目录号：F-8813）
琼脂糖
青霉素/链霉素（10.000单位/ml; Gibco ，目录号：15140）
HEPES Pufferan（Carl Roth，目录号：HN78.3）
珠子解决方案（参见配方）
5x MBSH（Modified Barth's Saline）（参见配方）

设备

尖锐钳（Fine Science Tools，目录号：Dumont＃5）
微刀片（Fine Science Tools，Dissecting Knife - Fine Tip）
切片（培养皿底部覆盖1％MBSH的1％琼脂糖）
移液管（Carl Roth，型号：EA65.1）
玻璃染色块（Karl-Hecht Assistent（Lymphbecken）2020）
显微镜载玻片
盖舌
5毫升注射器
凡士林
配备数码相机（广角镜头）的荧光显微镜
大培养皿充满PBS或MBSH用于外植体检索

程序

将非洲爪蟾胚胎提升到阶段17（Nieuwkoop等人，1994）。
通过将凡士林填充的注射器的开口直接放置在显微镜载玻片上，构建柔性成像室（图1）。轻轻按下活塞释放凡士林，在滑块上绘制一个矩形（约1.5 x 1厘米）。确保矩形已关闭。用小珠溶液填充矩形，直到它有一个凸弯月面

图1.柔性成像室
切割背外植体（参见Blum等人，2009年的图2）：
1. 将阶段17胚胎转移到填充1x MBSH的切片培养皿中
2. 用微型刀片，通过横向切割胚胎的前部来移除头。
3. 直立杯形胚胎，让你可以看到里面。然后在左侧和右侧的"侧线"放置小交替切口，直到您到达外环凸缘区域。
4. 用钳子和微型刀片，拉开胚胎的背侧和腹侧两半，直到你看到从里面打开blastopore。
5. 将最后切口腹部到胚胎孔分离背部外植体与胚胎的其余部分。确保不要用镊子或刀片从里面触摸背外植体。
6. 你现在应该留下一个浴缸形的背部外植体，GRP放在最深的点
使用移液管，小心地将背外植体带入含有FluoSphere珠溶液的玻璃染色块，轻轻地吸取外植体上下在此培养基中，以确保FluoSpheres达到GRP。
通过小心吸取转移背外植体到FluoSphere溶液填充室。确保外植体从不接触任何液体的表面，因为表面张力分解组织。定向外植体，内部朝上，即。向你。
用盖子轻轻地向下推动弹性腔室，用打开的钳子密封。小心推动，直到盖玻片接触背侧外植体的边缘，即左右侧线和腹外侧环。
在向下推时，有时腹侧环绕颈环折叠并阻挡GRP。如果发生这种情况，盖玻片向后极的轻微阻力可以剪切外植体以允许GRP的成像。
让设置休息5-10分钟，以允许外植体变形，否则会在早期采集期间暗示假颗粒运动
将幻灯片放在您的（广角）荧光显微镜，并专注于GRP
激发与所需的FluoSpheres波长 - 你应该看到一个"星空"。现在将焦点调整到略高于GRP的焦平面。
注意：由于GRP纤毛的长度仅为5μm，向左流动只发生在上皮正上方的平面上（Schweickert et al。，2007）。为了方便找到正确的平面，聚焦到组织中，直到你看不到任何珠的荧光。现在小心改变焦平面，直到第一个珠子出现在焦点。
在野生型胚胎中，您应该看到移动到GRP左侧的粒子。在非洲爪蟾（Xenopus laevis）中，向左流动相对较慢（〜2.5μm/s），因此使用延时摄影术最好地可视化（Schweickert等人，2007）。根据进一步的分析，因此时间分辨率，获取至少2 fps的电影
为了在检查后检索背外植体，将完整的载玻片浸没在装有1x MBSH或1x PBS的大培养皿中，并用镊子小心地除去盖玻片。外植体应漂浮到缓冲液中，可以将其从移液管移至固定液中以进行进一步分析（原位杂交，免疫组织化学染色，等）。

食谱

珠溶液
稀释FluoSpheres 1：2,500在1x MBSH中（制备〜5ml）
5×MBSH（1L）
注意：使用前，用H _{2 O 稀释为1x/
25.7g NaCl
0.375克KCl
1g NaHCO 3 3/h 1g MgSO 4。 7H 2 0.39g（CaNO 3）sub 2+。 4H 2 O 0.3g CaCl 2 。 2H 2 11.9g Hepes
5ml青霉素/链霉素}

致谢

这项工作得到了德意志交响乐团对M.B.

参考文献

Blum，M.，Beyer，T.，Weber，T.，Vick，P.，Andre，P.，Bitzer，E。和Schweickert，A。（2009）。非洲蟾蜍，一个理想的模型系统，研究脊椎动物的左右不对称性。 Dev Dyn 238（6）：1215-1225。
Nieuwkoop，P。和Faber，J。非洲爪蟾正常表（Daudin），1994，GARLAND PUBLISHING，New York& London，美国。
Schweickert，A.，Weber，T.，Beyer，T.，Vick，P.，Bogusch，S.，Feistel，K。和Blum，M。（2007）。纤毛驱动的向左流动决定了非洲爪蟾的偏侧性。 Curr Biol 17（1）：60-66。