材料和试剂

人MDA-MB-231细胞（ATCC，目录号：HTB-26 TM）
Dulbecco's改良的Eagle培养基（DMEM）（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：10313-021）
胎牛血清（FBS）（ATCC，目录号：30-2020 TM）
胰蛋白酶-EDTA（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：25200-056）
胰蛋白酶抑制剂（大豆）（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：17075-029）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：14190-144）
胶原I（Sigma-Aldrich，目录号：C7661）或纤连蛋白（BD Biosciences，目录号：354008）
戊二醛（Sigma-Aldrich，目录号：G6257）
乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：459836）
结晶紫（Sigma-Aldrich，目录号：C3886）
TCC配制的Leibovitz's L-15培养基（ATCC，目录号：30-2008 TM）

设备

（Sigma-Aldrich，目录号：CLS3421）或Millicell细胞培养插入器（EMD Millipore，目录号：PI8P01250）的缓冲液中。
棉签
细胞培养孵育器：37℃和5％CO 2/h

程序

携带MB-231细胞在含10％FBS的DMEM中（如果需要，使用L-15培养基）
用1x PBS洗涤细胞两次并胰蛋白酶消化
在PBS中加入0.5mg/ml胰蛋白酶抑制剂以灭活等体积的胰蛋白酶。通过轻轻地上下吸液吸取细胞（注意：尽可能细分为单个细胞是非常重要的）。
轻轻地旋转细胞。用含有0.5％FBS的DMEM洗涤细胞两次，以除去痕量的胰蛋白酶和抑制剂。重悬细胞在含有0.5％FBS的DMEM中并计数
准备transwell隔室，24孔格式，具有8μm孔径插入：
1. 向下部室加入2.6ml含有40μg/ml胶原I的0.5％FBS的DMEM。
2. 通过将插入物的底部合并到下室中的培养基中，将孔中的插入物添加到孔中。
注意：确保插入膜和介质之间没有气泡。
到上隔室，轻轻加入来自步骤4的1×10 5个细胞
孵育transwell板中的细胞在37℃和5％CO 2下2.5小时。这允许细胞迁移到插入过滤器的下侧。
2.5小时后，小心取出插件。不通过孔迁移并因此保留在滤膜上侧的细胞需要用棉签轻轻去除。用棉签轻轻擦拭滤膜的上侧，以除去细胞碎片。我们建议仅使用每个干净的棉签进行一次擦拭，在一个方向上，不要在前后运动中滑动。根据需要，棉签可以用ddH 2 O轻微润湿，但必须除去任何过量的水。可能需要几次擦拭以完全去除膜上的任何细胞碎片
用5％戊二醛快速固定插入过滤器下侧的细胞10分钟
接下来，用1％结晶紫在2％乙醇中的插入过滤器下侧的染色细胞20分钟
通过快速合并ddH <2> O中的插入物3至4秒除去过量的结晶紫。使用棉签从插件的侧面排出多余的水。干燥插入膜。
在显微镜下计数过滤器下侧的细胞数。随机选择不同的视图并进行平均计数。
应该对没有化学引诱物的对照组进行相同的实验程序。每个迁移条件都应该用重复测试。

致谢

该方案在美国加利福尼亚州La Jolla的Scripps研究所的免疫学部开发，并改编自Katoh等人。（2006）和Nakamizo等人（2005）。该工作由NIH资助，CA079871和CA114059，以及加利福尼亚大学的烟草相关疾病研究计划，15RT-0104给Jiing-Dwan Lee博士[见Chen等人]。（2009）]。

参考文献

Chen，Y.，Lu，B.，Yang，Q.，Fearns，C.，Yates，J.R.，3rd和Lee，J.D。（2009）。组合整合素磷蛋白分析和基于小干扰RNA的功能筛选确定了癌细胞粘附的关键调节因子，。 Cancer Res 69（8）：3713-3720。
Katoh，H.，Hiramoto，K。和Negishi，M。（2006）。 RhoG对Rac1的激活调节细胞迁移。 111（Pt 1）：56-65。
Nankamizo，A.，Marini，F.，Amano，T.，Khan，A.，Studeny，M.，Gumin，J.，Chen，J.，Hentschel，S.，Vecil，G.，Dembinski， Andreeff，M。和Lang，FF（2005）。人骨髓间充质干细胞在治疗胶质瘤中的应用 Cancer Res 65（8）：3307-3318。