材料和试剂

Fura 2-AM（Life Technologies）
DMSO（Sigma-Aldrich）
EGTA
CaCl <2>
HEPES
台盼蓝
FCS
真空润滑脂
腹膜巨噬细胞从Balb/c雄性小鼠（8-12周龄）腹腔注射后4天获得。施用2.5ml的3％巯基乙酸溶液
注意：在我们的研究中（Traves等人，2013），前列腺素E对P2X/T细胞应答的作用， P2Y激动剂ATP和BzATP的深入研究。所有这些分子购自Sigma-Aldrich（St.Louis，MO）。
10x DPBS，不含Ca 2+ 2 + Mg 2+ 2 + （Lonza）
洛克溶液（参见Recipes）（补充有1mg/ml BSA）

设备

盖片厚度0.13-0.16mm（直径15mm）（SCHOTT AG）
镊子
35毫米培养皿
基础水夹套CO 2子培养箱
灌注室RC-25F（Warner Instruments）
用于细胞灌注的阀门（Warner Instruments）
灌注阀控制器VC 8（华纳仪器）
真空泵
水浴
具有Plan Fluor x20/0.5水物镜（Nikon Corporation，型号：TE-200）的NIKON TE-200显微镜
二向色镜（430nm）和510nm带通滤光器（Omega Optical）
ORCA-ER C4742-80照相机（Hamamatsu Photonics K.K.，型号：C4742-80）
滤光片Lambda 10-2（Sutter仪器公司）

软件

MetaFluor 6.2r& PC软件（UNIVERSAL SOLUTIONS）

程序

首先，将无菌盖玻片置于培养皿的底部（镊子可能是有帮助的），其中细胞从一开始就粘附。然后将巨噬细胞小心地接种在1ml补充的洛克氏溶液中，密度为每35mm培养皿300,000-500,000个细胞。由于它们是非分裂细胞，它们在接种后的两或三天内使用（可能在这段时间之后，巨噬细胞将完全粘附到盖玻片上）。用500μlPBS 1X（三次重复）广泛洗涤以确保细胞非常粘附和存活。培养3天后凋亡/坏死细胞的百分比低于5％（通过使用常见的台盼蓝染色确定，参见注释）。
注意：连接到盖玻片的细胞是进行微量荧光分析的关键步骤。如果您的塑料或玻璃干扰巨噬细胞的粘附，允许支架用FCS（胎牛血清）在机舱下干燥，以提高粘附。避免高密度细胞培养。需要50-75％的亚融合培养物，其中一些细胞相互作用。
在加载了5-7μMFura-2-AM（溶解在DMSO中，根据数据表说明书）的1ml补充的Locke's溶液中孵育巨噬细胞，大约在37℃下孵育45分钟。孵育不涉及摇动或搅动，只是短暂和略微平衡
用新鲜的500μlLocke's溶液（血清还含有可能降解Fura-2-AM的酯酶）彻底洗涤培养物单层，并将盖玻片置于小的表面灌流室（34μl体积）中。盖玻片和腔室之间的接合用真空油脂密封。图1描述了超熔室设备注意：Locke的介质或灌注到腔室的产品使用通过重力工作的阀系统来调节。将灌注溶液保持在37℃的水浴中，并将流速保持恒定在1.5ml/min。真空泵在到达室后连续地使灌注介质前进，以防止水解产物的累积。
图2显示了这里描述的实验设置。

图1.表面灌注室系统。在图的上侧，我们可以欣赏超融合室和显微镜台。紧接在这两张照片的下面，两片都已经组装好了。盖玻片应放在剩余的圆形中空中。

图2. Fura-2-AM寄存器的实验设备温度和阀门控制器，荧光显微镜（包括其光学过滤器更换器）和记录荧光图像的必要设备（相机和其控制器）如上所述。
对照和处理的细胞的图像使用显微镜的Plan Fluor×20/0.5物镜可视化。在这方面，Fura-2-AM已经进入细胞，并且细胞内酯酶已经水解该化合物，提供以高亲和力感测Ca 2+ 2 +的游离Fura-2。当细胞在340nm激发时，荧光发射在430nm附近的宽范围内发生注意：在我们的研究中（Traves等人，2013），巨噬细胞与不同的前列腺素预孵育至少10分钟，然后用各种嘌呤能受体激动剂以接近最大有效浓度刺激30秒：100μM ATP，100μMUTP，10μMUDP，10μM2MeSADP，1,000μMα，β-meATP或300μMBzATP。
在340/380nm处激发细胞300ms（<5ms波长变化），并使用分色镜（430nm）和510nm带通滤光片选择发射的光。
注意：这些波长的选择与Fura-2钙饱和溶液（340nm）和无钙Fura-2溶液（380nm）的最大荧光寄存器匹配。
每1.5秒用相机采集荧光图像，并由软件控制。采样频率为2 Hz。

数据分析

通过对来自单个细胞内的小椭圆区域的信号进行平均来处理图像（图3）。存在定义荧光发射的改变的特定区域（细胞接触相互作用，在细胞质细胞偏振中的突起，或者简单地具有不同形态的细胞 - 形状巨大的巨噬细胞，取决于处理）的可能性。
注意：从每个波长中减去背景信号。

图3.细胞的Metafluor屏幕截图。ROIs（荧光发射的移动被记录为时间的函数的细胞）和背景（通常在没有细胞或非应答细胞的区域观察）在图像中用点标记。左侧的比例尺是指时间变量（以秒为单位）。
F340/F380比率基于表示初始瞬态分量的初始峰值幅度计算（图4）。使用Grynkiewicz方程将所述F340/F380比率转换为已知的钙浓度：
[Ca sup 2+] = Kd *（R-R sub）/（R max max）/F max 380+ sub>/F _380min （Grynkiewicz et al。，1985）
哪里：
1. Kd是解离常数（取决于指示剂，但也取决于pH，离子强度，细胞系，等）。
2. R是在两个波长（F340/F380）处观察到的荧光比率
3. R _min是最小比值（在没有Ca ^{2 +}的情况下）。
4. R submax是最大比率值（当Fura-2被Ca ^2饱和时）。
5. F sub 380/F 380min是比例因子（在没有Ca 2+和Ca 2+的情况下在380nm激发下的荧光强度） 2 + 饱和度）。
  注意：需要校准曲线来计算Kd值。值在相同实验条件（Fura-2-AM浓度，暴露时间...）的每个分析结束时获得。它基于两个校准点，分别对应于饱和的钙溶液（2.5mM CaCl 2 <2mM ）的最大值和最小值，无钙溶液（含有10μMEGTA）。或者，用200nM毒胡萝卜素或500nM叔丁基苯氢醌对膜网膜Ca 2+泵的抑制允许细胞质Ca 2+的饱和，/em> ^{2 +}集中。用低剂量的离子霉素（约1μM）处理保持在缺乏或含有Ca 2+ 2+的细胞外培养基中的细胞以改善入口的Ca _{2 +}
  
  图4.在340/380nm测量的荧光。 A.在两个记录的激发波长下的荧光强度。 B.随时间获得的寄存器被划分以确定F340/F380比率

笔记：

台盼蓝染色可用于区分存活和非存活细胞。协议遵循以下典型步骤：
1. 在0.4％台盼蓝染料溶液（应在使用前无菌过滤）中稀释细胞样品（1:10）至总体积为20μl。
2. 虽然非活细胞将是蓝色的，但活细胞将是未染色的。
3. 小心地并连续地用10μl的每个室的溶液填充血细胞计数器室（所有血细胞计数器由两个室组成;每个室被分成9个1mm <2μm的正方形）。
4. 在显微镜下在四个1×1mm方形的一个室中计数细胞，并确定每平方的细胞的平均数量。如果细胞密度高于200个细胞/平方，你应该稀释你的细胞悬浮液。
5. 细胞样品中每ml的颗粒总数可以如下计算：细胞平均数×1 /稀释因子×10 4细胞/ml。

食谱

洛克的解决方案组成
140mM NaCl 4.7 mM KCl
2.5mM CaCl 2·h/v 1.2mM KH 2 PO 4 4/
1.2mM MgSO 4 5.5mM葡萄糖 10mM HEPES，pH7.4

致谢

这项工作得到来自ISCIII的授权CP11/00080，来自MICINN的BFU2011-024760和FIS-RECAVA RD12/0042/0019的支持。 RECAVA和Ciberehd网络由Carlos III健康研究所资助。该程序的概述在Traves等人（2013）中描述。

参考文献

Traves，PG，Pimentel-Santillana，M.，Carrasquero，LM，Perez-Sen，R.，Delicado，EG，Luque，A.，Izquierdo，M.，Martin-Sanz，P.，Miras- Portugal，MT和Bosca ，L.（2013）。巨噬细胞中前列腺素E2对P2Y信号的选择性损伤：Ca ^{2 + <> J Immunol 190（8）：4226-4235。}
Grynkiewicz，G.，Poenie，M。和Tsien，R.Y。（1985）。新一代的Ca ^{2 +}指标，具有大大改善的荧光特性。 J Biol Chem 260（6）：3440-3450。
Traves，PG，Pimentel-Santillana，M.，Carrasquero，LM，Perez-Sen，R.，Delicado，EG，Luque，A.，Izquierdo，M.，Martin-Sanz，P.，Miras- Portugal，MT和Bosca ，L.（2013）。通过前列腺素E2在巨噬细胞中对P2Y信号的选择性损伤：对Ca 2+依赖性反应的影响。 em Immunol 190（8）：4226-4235。

Tsien，R.Y.，Rink，T.J.and Poenie，M。（1985）。使用荧光显微镜在单个小细胞中测量胞质游离Ca 2+ 2 + 具有双重激发波长。 Cell Calcium 6（1-2）：145-157。