材料和试剂

用于细胞内ATP含量评价
1. 鼠胚胎成纤维细胞（MEF）
2. 用L-谷氨酰胺（DMEM）（Gibco ，目录号：11965）的Dulbecco改良Eagle培养基高葡萄糖
3. 胎牛血清（FCS）（Gibco ，目录号：16010）
4. 青霉素/链霉素（Gibco ，目录号：15070）
5. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）（EuroClone，目录号：E0B4004L）
6. 蛋白染料试剂浓缩物（Bio-Rad Laboratories，目录号：500-0006）
7. 牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A4503）
8. NaCl
9. Na HPO 4/NaH <2> PO 4
10. 甘油
11. Triton X-100
12. 完全蛋白酶抑制剂（Roche Diagnostics，catlalog number：11697498001）
13. 磷酸酶抑制剂（1mM终浓度的甘油磷酸盐，原钒酸钠和氟化钠）
14. 完全蛋白酶抑制剂（Roche Diagnostics）
15. ATP终止试剂盒（Life Technologies，目录号：A22066）
16. 裂解缓冲液（见配方）
17. 标准反应溶液（参见配方）
乳酸盐定量
1. MEF
2. EnzyChrom TM L-乳酸盐测定试剂盒（BioAssay Systems，目录号：ECLC-100）
3. Dulbecco改良的Eagle培养基具有稳定的L-谷氨酰胺（DMEM）的高葡萄糖（Gibco ，目录号：11965）
4. 胎牛血清（FCS）（Gibco ，目录号：16010）
5. 青霉素/链霉素（Gibco ，目录号：15070）
6. 0.4％台盼蓝染料（Life Technologies，目录号：T10282）

设备

用于细胞内ATP含量评价
1. 6孔板（Corning，Costar ，目录号：CLS 3506）
2. 细胞刮刀（Nunc ，目录号：179707）
3. 光度计Gloomax 20/20
4. 分光光度计
5. 37℃5％CO 2细胞培养箱
6. 离心机旋转速度：15682,186G力（13,000rpm，8,3cm半径）
乳酸盐定量
1. 37℃5％CO 2细胞培养箱
2. 6孔板（Corning，Costar ，目录号：CLS 3506）
3. 96孔板（Corning，Costar ，目录号：CLS 3596）
4. 伯爵夫人自动细胞计数器与伯爵夫人细胞计数室幻灯片（生命技术）
5. 读板仪在565 nm

程序

用于细胞内ATP含量评价
1. MEF以60-70％细胞汇合铺板
2. 用PBS洗涤细胞两次
3. 将细胞用细胞刮刀在4℃下在含有磷酸酶抑制剂（1mM终浓度的甘油磷酸盐，原钒酸钠和氟化钠）的35μl裂解缓冲液中裂解30分钟。
4. 在4℃下以13,000rpm离心15分钟
5. 上清液是分离的。
6. 在Biorad溶液（200μlBiorad和800μl水）中以1:1000稀释样品（1μl样品加入到1000μlBiorad溶液中）。
7. 在分光光度计上在595nm读取光密度（OD）
8. 使用来自BSA的标准曲线确定样品的浓度
9. 将样品稀释至终浓度为25ng/ml
10. 向90μl标准反应溶液中加入250ng总蛋白质（与ATP标准曲线（0nM，1nM，10nM，100nM，1,000nM ATP）平行）10μl。
11. 用光度计测量荧光素酶活性
12. 使用ATP标准曲线对每个样品的ATP进行定量。
乳酸定量
1. 将细胞置于具有3ml培养基（10％DMEM-FCS-1％青霉素/链霉素）的6孔板中。
2. 当细胞达到100％细胞汇合时，培养基更换
3. 24小时后收集培养基。
4. 将细胞胰蛋白酶化，并用台盼蓝1：1计数活细胞
5. 收集的培养基在13,000rpm离心10分钟
6. 将上清液（清洁培养基）在DMEM中以1:10稀释。
7. 将20μl每种样品和标准曲线（0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.6,0.8和1mM乳酸盐的DMEM溶液）置于96孔板的孔中。
8. 将80μl来自EnzyChrom L-Lactate Assay Kit的测定缓冲液加入每个孔中。
9. 混匀（向上和向下吸取）。
10. 在孵育开始（t0）和20分钟（t20）后D0被吸收565nm
11. 测定样品和标准曲线的吸光度差（ΔOD）
12. 每个样品的乳酸盐浓度从标准曲线获得
13. 乳酸盐的量通过细胞的最终数量归一化。

食谱

裂解缓冲液
150mM NaCl 20mM Na 4 HPO 4 sub/NaH 2 PO 4 sub/4 NH 4 10％甘油 1％Triton X-100（pH7.2）完全蛋白酶抑制剂
标准反应溶液
1×反应缓冲液
0.1mM DTT（二硫苏糖醇） 0.5ml 0.5mM D-荧光素
2.5μg/ml萤火虫荧光素酶并在室温下孵育15分钟（在黑暗中）

致谢

我们感谢文章的所有共同作者：Chiaravalli，M.，Mannella，V.，Ulisse，V.，Quilici，G.，Pema，M.，Song，X.W.，Xu，H。 Mari，S.，Qian，F.，Pei，Y。和Musco，G。和实验室Boletta的其他成员。

参考文献

Rowe，I.，Chiaravalli，M.，Mannella，V.，Ulisse，V.，Quilici，G.，Pema，M.，Song，XW，Xu，H.，Mari，S.，Qian，F.，Pei ，Y.，Musco，G。和Boletta，A。（2013）。多囊肾病中的葡萄糖代谢不足确定了一种新的治疗策略。 Med 19（4）：488-493。