材料和试剂

乙二醇 - 双（2-氨基乙醚）-N，N，N'，N'-四乙酸（EGTA）（≥97.0％）（Sigma-Aldrich，目录号：E3889）
鸟苷5'-三磷酸钠盐水合物（GTP）（≥95％）（Sigma-Aldrich，目录号：G8877）
DL二硫苏糖醇（DTT）（≥99.0％）（Sigma-Aldrich，目录号：43819）
腺苷5'-三磷酸镁盐（ATP）（95-98％）（Sigma-Aldrich，目录号：A0770）
PIPES二钠盐（≥99％）（Sigma-Aldrich，目录号：P3768）
甘油（≥99％）（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
MgCl 2（≥98％）（无水）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
蔗糖（≥99.5％）（Sigma-Aldrich，目录号：S9378）
紫杉醇（来自短叶红豆杉的紫杉醇）（≥95％）（Sigma-Aldrich，目录号：T7402）
牛微管蛋白（冻干，> 99％纯）（CYTOSKELETON，目录号：TL238-B）
兔骨骼肌的肌动蛋白蛋白（冻干，> 99％纯）（CYTOSKELETON，目录号：AKL99）
2D Quant Kit（通用电气公司）或Bradford蛋白质测定试剂盒（Bio-Rad Laboratories）
微管蛋白稀释缓冲液（TDB）（参见配方）
甘油缓冲液（GB）（参见配方）
"蔗糖缓冲液"缓冲液（SC）（参见配方）
一般肌动蛋白缓冲液（A缓冲液）（参见配方）
聚合诱导剂（PI）（参见配方）
F-肌动蛋白的缓冲缓冲液（参见配方）

设备

用于裂解细胞和组织的装置（用于细胞裂解的装置的类型取决于一个正在工作的细胞系统;动物细胞可以容易地裂解，而植物细胞由于细胞壁的存在而需要更多的能量方法例如在液氮下冷冻和用杵和砂浆粉化，因此不可能给出精确的指示，但我们倾向于选择个体操作者。）
电泳装置（Mini-PROTEAN II电泳细胞）（Bio-Rad Laboratories）
装备有70Ti固定角转子和用于4ml聚合管的适配器的超速离心机（Beckman Coulter，型号：Optima LE-80K）
Bio-Rad Mini-Trans-Blot细胞仪（可选）

软件

ImageJ或Bio-Rad数量一

程序

微管结合测定
1. 可溶（细胞质）提取物的制备
  1. 该步骤必须取决于其上正在工作的细胞或组织。理论上，在复杂组织的情况下，使用塑料Eppendorf杵或Ultra-Turrax匀浆器，可以在裂解缓冲液中直接裂解软组织（例如动物组织）。对于植物细胞，优选在液氮下冷冻感兴趣的组织，然后用研杵和研钵研磨。在组织完全粉末化后，使液氮蒸发。将组织粉末移至合适的管，如eppendorf管或15-ml锥形管（取决于起始材料的量）。加入裂解缓冲液，将样品在4℃或冰上温育15分钟，伴随温和搅拌。最后，将样品高速离心（> 100,000×g），用于沉淀细胞碎片并在上清液中获得胞质蛋白。虽然可溶性蛋白质的提取物可以在液氮下冷冻并储存在-80℃，我们总是喜欢使用新鲜材料，因为难以估计提取物的时间稳定性。裂解缓冲液的组成可以从物种调整到物种，请参考关于特定组织的文献，以确定最佳裂解缓冲液。
  2. 确定细胞质提取物的蛋白质浓度，以混合已知的蛋白质量。几种商业试剂盒可用于测定蛋白质浓度（例如2D Quant Kit或Bradford Protein Assay试剂盒）。总是取等分试样进行电泳。
2. 微管的制备
  1. 解冻冻干的微管蛋白（动物或植物来源，1毫克）一等分，然后加入200微升TDB，使最终浓度为5毫克/毫升。
  2. 加入25μl的GB，并在35℃下孵育20分钟
  3. 将1.8ml TDB与81μl500μM紫杉醇（TDB-T）混合。在35℃下孵育15-20分钟，使紫杉醇溶液的温度与微管蛋白相同。
  4. 在孵育结束时，向225μl的微管蛋白样品中加入1.8ml TDB-T。轻轻混合。在0.5mg/ml的浓度下，微管蛋白的最终体积为≈2ml。
  5. 通过将1.8ml TDB与81μl500μM紫杉醇混合制备另外的TDB-T
3. 准备绑定组合。
  混合细胞溶质提取物（可变量，例如从0到40 微升，以便工作范围在10-100微克蛋白）与微管样品的恒定体积（40μl）微升）。使用剩余卷添加其他物质（即抑制剂），然后将体积调整为100 微升与TDB-T缓冲液。体积可以相应地增加以适应不同的转子和管
4. 在室温下孵育样品30分钟。
  如果是实验中检查的变量，则可以调整试验温度。
5. 细胞骨架细丝的分离
  1. 在20℃下将样品在100,000×g离心40分钟，超过0.5ml蔗糖缓冲缓冲液。
  2. 离心后，上清液位于蔗糖垫上方，因此可以用移液管除去而不接触蔗糖垫。处理上清液进行电泳。
  3. 将颗粒直接重悬于适于电泳分析的变性缓冲液（例如Laemmli缓冲液）（最大100微升）。
6. 分析
  通过电泳测试单个级分（上清液和沉淀）（SDS-PAGE）和可能通过蛋白质印迹，后者被要求具体确定和量化感兴趣的蛋白质
肌动蛋白丝结合测定
1. 细胞裂解液的制备
  1. 它取决于特定的组织或细胞，一个正在工作。有关详细信息，请参阅先前的协议。
  2. 使用商业试剂盒（如2D Quant Kit或Bradford Protein Assay试剂盒）确定样品的蛋白质浓度，并始终收集一个等分试样进行电泳。
2. 肌动蛋白丝的制备
  1. 解冻冻干肌动蛋白（动物或植物来源，1毫克）一等分
  2. 通过加入100μl的A缓冲液将肌动蛋白稀释至10mg/ml的浓度。从管中取出溶液（通常是Eppendorf管），并置于5ml或15ml管中
  3. 用A缓冲液（100μl肌动蛋白+ 2.4ml A-缓冲液）以0.4mg/ml的浓度稀释肌动蛋白。在冰上孵育1小时（不需要搅拌）。
  4. 加入聚合诱导剂1x终浓度：2.25ml + 0.25ml肌动蛋白聚合诱导剂10x。在室温下孵育1小时
3. 准备绑定组合。
  混合细胞溶质提取物（可变量，例如从0到40 微升，以便工作范围在10-100微克蛋白质）与恒定体积的肌动蛋白丝样品（50 微升）。使用剩余卷添加其他物质（即抑制剂），然后将体积调整为100 微升与A-缓冲液/聚合诱导剂混合物（这是相同缓冲液的肌动蛋白溶液）。可以增加体积相应地适应不同的转子和管
4. 在室温下孵育样品30-60分钟。
  如果是实验中检查的变量，可以调整试验温度
5. 细胞骨架细丝的分离
  1. 在20℃下将样品以150,000×g离心60-90分钟，在0.5ml F-肌动蛋白缓冲缓冲液中。
  2. 取上清液并处理以进行电泳。
  3. 将沉淀重悬在100μl适合于电泳分析的变性缓冲液（例如Laemmli缓冲液）中。
6. 分析
  1. 通过电泳测试单个级分（上清液和沉淀）（SDS-PAGE）和可能通过蛋白质印迹，后者被要求特异性识别和定量感兴趣的蛋白质（图1） 1）。
  2. 在这两种情况下，可以使用图像采集系统和特定软件（免费如ImageJ或如Bio-Rad Quantity One）来进行蛋白质印迹分析后的条带的相对定量。
    
    图1.具有肌动蛋白丝的结合分析的实例。具体地，将来自兔骨骼肌（箭头）的蛋白质肌球蛋白与丝状肌动蛋白（箭头）一起温育。 S和P分别表示上清液和沉淀。泳道1，分子量标准，其值由左侧的数字指示。泳道2，肌球蛋白（市售）。泳道3-4，肌球蛋白与肌动蛋白丝孵育后得到的上清液和沉淀。泳道5-6，在5'-腺苷酰-β，γ-亚氨基二磷酸（AMPPNP，ATP的不可水解的类似物）存在下肌球蛋白与肌动蛋白丝孵育后获得的上清液和沉淀。泳道7-8，上清液和沉淀在ATP存在下用肌动蛋白丝孵育肌球蛋白后获得。注意，肌球蛋白在ATP存在下弱结合，但在AMPPNP存在下非常强

食谱

微管蛋白稀释缓冲液（TDB）
80mM Pipes，pH 6.8
1 mM EGTA
1mM MgCl 2
2 mM GTP
甘油缓冲液（GB）
80mM Pipes，pH 6.8
1 mM EGTA
1mM MgCl 2
60％（w/v）甘油
"蔗糖缓冲液"缓冲液（SC）
80mM Pipes，pH 6.8
1 mM EGTA
1mM MgCl 2
10％（w/v）蔗糖 20μM紫杉醇
一般肌动蛋白缓冲液（A缓冲液）
5mM Tris-HCl pH8.0
0.2mM CaCl 2·h/v 0.2 mM ATP
0.5 mM DTT
10x聚合诱导剂（PI）
500 mM KCl
20mM MgCl 2/
10 mM ATP
F-肌动蛋白缓冲液
5mM Tris-HCl pH8.0
2mM MgCl 2/
50 mM KCl
10％（v/v）甘油

致谢

该方案改编自以前发表的文章：Del Duca等人（2013）。这项工作得到了意大利大学和研究部资助的PRIN 2007（授予号2007RZCW5S_003）和PRIN 2008（授予号2008BK7RXB）和博洛尼亚大学（RFO 2010 [授予号RFO10DELDU]和RFO 2011 [授权号RFO11DELDU]）到SDD

参考文献

Cai，G.，Faleri，C.，Del Casino，C.，Emons，A.M。和Cresti，M。（2011）。烟草花粉管中胼lose质合酶，纤维素合酶和蔗糖合酶的分布受到不同方式的控制肌动蛋白丝和微管。植物生理学 155（3）：1169-1190。
Del Duca，S.，Faleri，C.，Iorio，R.A.，Cresti，M.，Serafini-Fracassini，D.and Cai，G.（2013）。梨花粉管中转谷氨酰胺酶在细胞骨架和膜动力学方面的分布。植物生理学 161（4）：1706-1721。
Del Duca，S.，Serafini-Fracassini，D.，Bonner，P.，Cresti，M.and Cai，G。（2009）。由花粉转谷氨酰胺酶催化的翻译后修饰对微管和肌动蛋白丝的功能性质的影响。/a> Biochem J 418（3）：651-664。