材料和试剂

冷冻组织样品（成年小鼠外胚层）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
蛋白酶抑制剂混合物片剂（cOmplete，Mini，无EDTA）（Roche Diagnostics，目录号：11 836 170 001）
牛血清白蛋白（BSA）（PBS中的储备液为30mg/ml）（Sigma-Aldrich，目录号：A4503）
小牛血清（Life Technologies，目录号：16170-086）
主要抗体：
小鼠抗NeuN抗体（克隆A60）（EMD Millipore，目录号：mab377）
兔抗EGR1抗体（克隆T.126.1）（Thermo Fisher Scientific，目录号：MA5-15009）
次级抗体：
Alexa Fluor 647山羊抗小鼠IgG（H + L）抗体（Life Technologies，目录号：A21236）
Alexa Fluor 488驴抗兔IgG（H + L）抗体（Life Technologies，目录号：A21206）
碘化丙啶（储备液1mg/ml，在高压灭菌水中制备）（Sigma-Aldrich，目录号：P4170）
RNA酶A（储备液1mg/ml，如制造商所示通过煮沸灭活）（Sigma-Aldrich，目录号：R5000）
DAPI（储存在100μg/ml，在高压灭菌水中制备）（Sigma-Aldrich，目录号：D9542）

设备

15 ml管
1.5 ml Eppendorf管
7ml Dounce匀浆器（WHEATON，型号：357542）
显微镜
冷冻离心机
高压灭菌的40μm尼龙过滤器
发射滤光片：BP 530/30，BP 616/23，BP 660/20，APC，FITC
装备有双氩（488nm）和氦 - 氖（633nm）激光的FACSAria细胞计数器（BD Biosciences）

软件

FACSDiva（BD Biosciences）
Modfit LT软件（Verity软件）

程序

细胞核分离
1. 制备包含PBS，0.1％Triton X-100和一片蛋白酶抑制剂混合物/10ml缓冲液的匀浆缓冲液。
  注意：在处理过程中将缓冲液和样品保存在冰上。
2. 转移一个小鼠的hemicortex（或等同质量的成年神经组织）到一个含有3毫升匀浆缓冲液的Dounce匀浆器。然后将组织与"松散"在冰上匀浆 "紧"杵，如制造商所示。
  注意：体积可以根据样品大小和复杂性（例如，对于来自E17胚胎或一个成年鼠海马的一个端脑泡的1ml匀浆缓冲液）缩放。可以平行处理几种组织，这将允许获得等分试样用于对照免疫染色（参见步骤B2）。
3. 收集样品，加入1.5ml PBS-0.1％Triton X-100（终体积4.5ml）
4. 在4℃下以200×g离心1.5分钟以除去未解离的组织（主要是血管）。
  可选：在这里和随后的离心步骤中，样品可以等分在1.5ml Eppendorf管中以改善沉淀的可视性。
5. 弃去沉淀并将上清液转移到15ml管中注意：在这一步，你可以删除一小部分的样品，应该用DAPI（100 ng/ml）或碘化丙啶（25μg/ml）标记至少1分钟，检查它在显微镜（图1，Homog。）。
6. 加入冰冷PBS至终体积12 ml 注意：体积可以根据样品大小和组织结构进行缩放。例如，对于胚胎组织，体积可以由于其低复杂性而降低（来自E17胚胎的一个端脑泡可以在1.5ml PBS中洗涤）。对于一个成年海马，需要5ml PBS。
7. 在4℃下以400xg离心4分钟。
8. 弃去上清液，小心地向沉淀中加入PBS（总体积为1-1.2ml）注意：
  1. 关键步骤：不要打扰沉淀，或尝试在此时重新悬浮沉淀。至关重要的是不要打扰细胞核以维持其完整性！
  2. 在该步骤中，可以除去上清液的一小部分，并且在加入DAPI（100ng/ml）或碘化丙啶（25μg/ml）后，在显微镜下检查细胞核不存在（图1， Supernat。）。
9. 保持细胞核丸在冰上20-30分钟。
10. 通过轻轻旋转小瓶（直到没有可观察到的块状物），然后通过上下吹吸来重悬沉淀。
  注意：
  1. 在该步骤中，除去样品的一小部分，并且在加入DAPI（100ng/ml）或碘化丙啶（25μg/ml）后，在显微镜下检查细胞核的质量（图1，样品）。
  2. 样品可以在4℃下储存几小时直至免疫染色，并且在细胞周期分析中储存24小时。
11. 如果不需要免疫染色，则进行步骤B6
  
  图1.在细胞核分离过程中获得的等分试样的显微图像。在步骤A5（Homog。），A8（Supernat。）和A10（Sample）中获得的样品的等分试样用DAPI（蓝色）染色。
新鲜/未固定细胞核免疫染色
1. 为了阻断非特异性免疫染色，向400-500μl在步骤A10中获得的细胞核悬液中加入4-5μl小牛血清和6.4-8μlBSA（30mg/ml）。通过倒置混合，并且进一步延迟。
2. 通过汇集步骤A10中获得的细胞核悬液的小等分试样，并且阻断如上所示的非特异性免疫染色，制备三个对照样品（每个400-500μl）：
  1. 二抗抑制（CONT）。
  2. NeuN的阳性对照（POSITIVE NEUN +）。
  3. 正向控制EGR1（正向EGR1 +）。
    注意：这允许保持足够的体积与在步骤A10中获得的细胞核悬液进行至少两种不同的免疫染色（即使对于小组织如海马）。
3. 添加抗核蛋白的一抗/抗体，通过倒置混合：
  1. 二抗抑制：无一抗。
  2. NeuN的阳性对照：在500μl样品中的0.6μl小鼠抗NeuN
  3. EGR1的阳性对照：在500μl样品中1μl兔抗-EGR1
  4. 样品：在500μl样品中的0.6μl小鼠抗NeuN和1μl兔抗-EGR1 注意：其他初级抗体的稀释度应该根据经验进行优化（通常与免疫组织化学使用的相同或两倍的浓度应该是一个不错的选择）。如果可能，选择已知识别未固定/天然表位的抗体（即经过免疫沉淀验证）。
4. 不洗涤，向所有样品（包括对照）中加入1/500稀释的二抗/抗体，并通过倒置混合注意：我们将主抗体和次抗体组合以避免可能导致材料损失的重复清洗步骤。确保您使用的荧光团都是可激发的，可以通过细胞仪检测，并且它们与彼此的激发/发射光谱以及与碘化丙啶的激发/发射光谱兼容。
5. 在4℃下在黑暗中孵育过夜（无振荡）注意：或者，样品可以在室温下孵育2小时。
6. 小心地重悬沉淀的核，并且在不洗涤的情况下，通过40μm高压灭菌（即不含DNase的）尼龙过滤器过滤样品。
  注意：在该步骤中，除去样品的一小部分，并且在加入DAPI（100ng/ml）或碘化丙啶（25μg/ml）后，在显微镜下检查免疫染色信号（图2）/em>
  
  图2.免疫染色后获得的细胞核的等分试样的显微图像
7. 向样品中加入碘化丙啶至终浓度为25-50μg/ml和无DNA酶的核糖核酸酶A至终浓度为25μg/ml。
流式细胞仪门控和分析
1. 使用流式细胞仪分析样品。
  注意：在我们的情况下，我们使用配备双氩（488nm）和氦氖（633nm）激光的FACSAria细胞仪。发射过滤器：BP 530/30（对于Alexa 488），BP 616/23（对于碘化丙啶）和BP 660/20（对于Alexa 647）。使用线性数字信号处理收集数据。对于数据分析，我们使用FACSDiva和Modfit LT软件。
2. 在（前向散射）FSC对（侧向散射）SSC图中定位核子总体，并创建第一个门：P1（图3A）。
3. 通过在碘化丙锭-A对碘化丙锭 - 丙酸图中产生P2闸门（图3B），同时消除碎片（即IP未污染的群体）。这将大大改善在FCS-A对SSC-A图（图3C）以及P1的微调（图3A）的核的鉴定。
4. 通过在碘化丙锭-A对碘化丙锭-H图（图3D）上的门控（P3）选择单峰群体并排除双峰和团块（参见图4以进一步解释）。
  
  图3.用于检测成年小鼠大脑皮质核的轮廓图和门控方案
  
  图4.解释用于双重鉴别的程序的方案。由于碘化丙啶标记的核通过激光束，荧光信号被转换为由其高度（H），宽度W）和面积（A）。信号的积分面积（碘化丙啶-A）与DNA含量成比例。碘化丙锭的变量直接取决于粒子穿过激光束所花费的时间，碘化丙锭反映荧光信号的最大强度。由于其荧光信号的更高的H/A比和更低的W/A比，可以将4C单倍体（四倍体核）与双峰（两个二倍体核彼此粘附）区分开来（改编自López-Sánchez和Frade，2013 ）。
5. 通过检查碘化丙锭-A对碘化丙锭 - 碘图，确认所选群体中双联体的正确排除，如果需要，调整P3。具有4C DNA含量和高碘化丙啶-W的群体应消失（将图3E与图3F比较）。得到的总体由以下要分析的单子构成。
6. 在对照样品（CONT）中，使用发射滤光片APC（对于NeuN）和发射过滤器FITC（对于EGR1）确定荧光信号的背景阈值。可以确定表示直方图（图5A-B）中的单个信号或同时表示相同点图上的两个信号（图6A）的阈值。
  
  图5.代表NeuN（A）和EGR1（B）的二次抗体对照（CONT）中NeuN和EGR1的荧光信号的直方图，以及NeuN（C）和EGR1（B）免疫染色的样品群体（SAMPLE） D）
  
  图6.代表第二抗体对照（A），NeuN（B）阳性对照，EGR1（C）阳性对照和样品群体（D）的NeuN和EGR1的荧光信号的点图。
7. 在个别阳性对照中选择阳性群体（图5C-D和图6B-C）。这允许鉴定双标记群体（图6D）。
  注意：有时，感兴趣的核具有可用于定义特定细胞核群体的大小或复杂性的特定特征。例如，来自成年小鼠的大多数NeuN阳性细胞核具有比阴性细胞更高的SSC-A（图7）。这可以改善此群体的正确选通。
  
  图7. NeuN与SSC-A信号的点图
8. 最后，分析每个样品中感兴趣的群体的DNA含量。
  注意：该方法对于增殖组织中的细胞周期分析（图8A-B）和NeuN +细胞核中DNA含量的定量（图8C-D）都是有用的。
  
  图8.DNA含量分析。来自增殖组织的DNA含量的典型直方图（A），以及用Modfit软件（B）定量的其细胞周期相的分析。显示来自成年小鼠脑的非神经元（C）和神经元（D）细胞核的代表性直方图。 2C：二倍体，4C：四倍体

笔记

使用来自其他脊椎动物的神经组织，包括胚胎和孵化后的鸡（Lopez-Sanchez和Frade，2013）和人（未发表的数据）也获得了类似的结果。

致谢

该协议改编自Lopez-Sanchez和Frade（2013）的前一篇文章。实验工作由"Ministerio de Ciencia eInnovación"（BFU2009-07671和SAF2012-38316）和"FundaciónAreces"（CIVP16A1815）的赠款支持。 NoeliaLópez-Sánchez承认来自欧洲社会基金共同资助的CSIC计划"Junta para laAmpliaciónde Estudios"的JAE-Doc合同（JAEDoc026，2008年电话）。

参考文献

López-Sánchez，N.和Frade，J. M.（2013）。来自成人的皮质投影神经元中p75 ^NTR - 依赖性四倍体的遗传证据小鼠。 J Neurosci 33（17）：7488-7500。