材料和试剂

异氟烷
局部消毒杀微生物剂制备溶液（例如Medline Industries，目录号：MDS093906）
0.5％布比卡因
Hank's平衡盐溶液（HBSS）与Ca 2+ 2+，Mg 2+ 2+ （例如Life Technologies，目录号：14025）。
HBSS，不含Ca 2+ 2+ ，Mg ^{2 +}（例如Life Technologies，目录号：14175）
液氮
牛血清白蛋白（BSA）
Cytospin过滤卡（例如 Thermo Fisher Scientific，目录号：5991022）
Diff Quik溶液试剂盒（Fisher Scientific，目录号：NC9943455）
Cytoseal 60（VWR International，目录号：48212-154）
100x蛋白酶抑制剂混合物（例如 Calbiochem ，目录号：80053-844）
布比卡因
100mg/ml小鼠（大鼠）胃颗粒（见Recipes）
酸伤害溶液（酸）（参见配方）
胃颗粒损伤溶液（部分）（参见配方）
酸+颗粒损伤溶液（酸+部分）（参见配方）
磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.2（见Recipes）
氯化铵溶解缓冲液（见配方）
肺匀浆缓冲液（见配方）
50mM磷酸钾缓冲液，pH = 6.0（参见配方）
MPO匀浆缓冲液（见配方）

注意：除非另有说明，所有盐和其他化学物质均来自Sigma-Aldrich（但是，此类化学物质的任何来源可能都可以使用）。

设备

1-0编织丝材料，散装卷轴（例如查看目录号：MBJF210）
12 mm x 75 mm x 1 mm显微镜载玻片
2×2纱布海绵，8层（VWR International，目录号：82004-740）
无菌4×4纱布海绵，8层（VWR International，目录号：82004-742）
6-0单丝聚丙烯缝合线与P-13切割针（例如Syneture，目录号：SP-5695）
60°倾斜剥离板（自制有机玻璃）
注射器（0.5,1,3,5,20cc（立方厘米））
针（14，20，22，26，29规格）
气管套管（23号×1/2"不锈钢管适配器）（Becton，Dickinson and Company，目录号：408213）
3"弯曲锯齿镊子（2）
3"弯曲组织（"齿"）镊子
1.8 ml微量离心管
12 x 75毫米聚苯乙烯管
22 x 22毫米＃1.5盖玻片
4"弯曲显微解剖剪刀
37°C水浴
一次性皮肤吻合器（如 3M，型号：DS-25）
血细胞计数器或库尔特计数器（例如 Beckman Coulter，型号：MultiSizer III）
带有细胞离心管漏斗的细胞离心机（例如 Shandon CytoSpin ^®）
组织匀浆器（例如，Brinkmann ^TM Polytron ^TM，型号：PT2000）
探头超声仪（例如 Branson Sonifier ^®，型号：450）

程序

"损伤"程序
1. 用0.2ml空气"追加剂"然后"损伤"溶液（大鼠：1cc注射器，具有14号针头，具有0.5ml空气，兔子：5cc注射器，具有14号针头，2ml空气）。
2. 在以1-2L/min递送的3-4％异氟烷（兔：30mg/kg氯胺酮，在2％异氟烷之前肌内）递送的室中诱导麻醉（图1和图2）。暂停鼠标的前牙在60°斜面解剖板上用1-0缝合线保持麻醉，用鼻锥用2-2.5％异氟烷维持麻醉。
  
  图1.用于外科手术的实验室工作台设置。在通风橱中进行用于麻醉气体清除的木炭过滤的过程，其包括：小动物麻醉气体暴露室（右前），灯和有机玻璃60°倾斜解剖板（中间的罩）。在图片的左边，在发动机罩外的地板上，是用于输送异氟烷蒸气的麻醉蒸发器。
  
  图2.用于抽吸损伤程序的仪器。有机玻璃60°倾斜解剖板显示与鼻锥设置，以在手术期间提供异氟烷。绿色软管将100％氧气中的异氟烷递送到内部鼻锥，而较大孔蓝色软管提供真空用于通过外部鼻锥清除麻醉剂。还示出了（从左到右）：具有26号针的5cc注射器，其含有用于皮下注射的1.5ml生理盐水，具有22号针的0.5cc注射器，其含有损伤溶液和0.2ml空气"追加器"，3个弯曲解剖钳（2个锯齿状和1"齿状"），弯曲解剖剪刀，一个具有棉头敷药器的防腐抗微生物溶液瓶和6"股1-0编织丝线材料。图片缺失：一次性皮肤吻合器。
3. 剃刮腹侧颈，涂抹局部防腐制剂溶液，并用纱布除去多余的
4. 用100μl0.5％布比卡因（提供局部术后镇痛）浸润未来切口部位。
5. 用剪刀剪切皮肤上2厘米的纵向切口（图3）
  
  图3.颈切口用缝合线悬挂小鼠的前切牙，使其鼻子在内异氟烷鼻锥内（步骤A2），准备手术部位（步骤A3和A4 ），用剪刀和组织钳制作2cm纵向切口（步骤A5）
6. 通过钝性解剖用2个弯曲的无齿钳暴露气管（图4，5和6）
  
  图4.通过钝性解剖的气管暴露。用弯曲的锯齿镊子梳理筋膜，并且唾液腺被拉到侧面以暴露气管（在镊子之间的微白的垂直）被气管肌肉组织包围（步骤A6）
  
  图5.钝性解剖的气管暴露持续。握住气管肌肉组织的一侧，将其拉向侧面，同时沿着肌肉纵向摩擦。这将导致肌肉纤维束的分离并允许肌肉被反射到侧面（步骤A6）。注意内部和外部鼻锥配置，用于输送麻醉和清除。为了清楚起见，鼠标的鼻子位置低于通常的位置。
  
  图6.钝性解剖的气管暴露持续。使用两个弯曲的锯齿镊子反映气管的肌肉系统，完全暴露气管（步骤A6）。
7. 在气管下工作弯曲钳（图7）。并且使用通过（图8）拉出6"股1-0丝缝合材料
  
  图7.气管下工作弯曲锯齿钳（步骤A7）
  
  图8.使用镊子在气管下放置缝合线（步骤A7）
8. 通过去除鼻锥停止异氟烷给药。在通过以下步骤灌注伤害车辆之前，允许小鼠的麻醉平面上升，直到它刚刚开始对镊子脚趾捏合反应，然后迅速启动滴注步骤。特别是对于含酸的伤害车辆，如果麻醉平面太深，在伤害车辆被滴注之后动物将不会自发地呼吸。
9. 用缝合线提起气管，以便于用斜面外科医生（直到针的斜面刚好通过气管插入点）将伤口注射器针插入气管（在喉下方2-3个软骨环）（图9）。重要的是，针与气管尽可能平行，否则针可以容易地刺穿气管的另一侧。这将导致受伤车辆不被注射到肺中，并且很可能动物将不能存活
  
  图9.使用缝合线便于将损伤溶液注射到气管中。从倾斜板上取下鼻锥装置，以便不受限制地进入气管上段。用缝合线提起气管，以方便将损伤注射器针插入气管（喉下方2-3个软骨环）。注意针尖外科医生的斜面。提前针直到针的斜面刚好通过气管插入点（步骤A9）。重要的是，针与气管尽可能平行，否则针可以容易地刺穿气管的另一侧。这将导致损伤车辆不被注射到肺中，并且很可能动物将不能存活。虽然辅助挤压肋骨笼（以排出大部分重要的能力），快速灌注注射器内容。在注射开始之前释放胸部。这种操纵以及空气"追赶"确保伤害车辆沉积到远端肺中（步骤A10）。
10. 虽然辅助挤压肋骨笼（以排出大部分重要的能力），快速灌注注射器内容。在注射开始之前释放胸部。这种机动，以及空气"追赶"确保伤害车辆沉积到远端肺
11. 将动物留在倾斜板上，直到呼吸开始并用2个吻合钉闭合切口（对于大鼠和兔子：气管针伤口需要用一个6-0缝合线修复）（图10）。
  
  图10.用手术吻合钉闭合颈部皮肤切口（步骤A11）
12. 注射1ml（大鼠：10ml，兔子：20ml）无菌NS皮下注射到颈部的颈部用于液体复苏。在手术过程中实际上没有液体损失，但动物在手术后不会喝一会儿，并且可能脱水（图11）。
  
  图11.液体复苏使用带26号针的注射器将1 ml无菌NS皮下注射到颈部的颈部，用于液体复苏（步骤A12）。
13. 放入用100％O 2灌注的加热室（37℃）直到可走动（图12）。
  
  图12.恢复室。将鼠标放在连续灌注100％O 2（由绿色软管提供）并用加热灯保持在37℃的恢复室中，温度控制器（通知左室中的热敏电阻探针），直到鼠标走动（步骤A13）
收获程序（图13）

图13.用于收获的仪器和材料从左到右右：两个锯齿状解剖钳，组织（"齿"）镊子，解剖剪刀，23规格不锈钢蓝色hubbed套管，1 cc 血液采集注射器与26规针，支气管肺泡灌洗装置（顶部注射器，其填充有不含Ca 2+的5ml HBSS，Mg 2+），左注射器用于流体收集），两个2×2纱布海绵（左下）用于收缩腹部器官，和4"股1-0编织丝缝合（下，中）。图片缺失：5 cc注射器与26 包含具有Ca 2+ 2 H +的HBSS的5ml针，用于冲洗肺的脉管系统
1. 用100％O 2中的异氟烷麻醉小鼠。
2. 当小鼠无反应时，以仰卧位置放置在解剖板上，并用鼻锥继续异氟烷给药。
3. 使用镊子和剪刀，做一个纵向切口腹部到xyphid
4. 在腹部进行横向切口（图14），并使用纱布海绵反映腹部器官，暴露腔静脉和腹主动脉（图15）。
  
  图14.收集血液的腹部切口。使用镊子和剪刀，沿着腹部纵向切开至腹部，并穿过腹部进行横向切口（步骤B3和B4）。
  
  图15.收集血液。使用纱布海绵来暴露腔静脉和腹主动脉以反映腹部器官，并使用1cc注射器用26号针从两个容器中收集血液（步骤B4和B5）。< br />
5. 收集血液（用于评估全身性炎症反应（例如血清或血浆细胞因子水平））：
  1. 使用27号针头在1cc注射器（如果要分离血浆，注射器必须包含适当的抗凝剂）从腹主动脉收集血液（图15）。
  2. 腔静脉可用于收集血液，但通常不能从主动脉收集血液（图15）。
  3. 将血液分配到1.8 mlμ-fuge管中。直到血液可以被处理，如果血浆将准备在冰上，或保持在室温，如果血清将被准备。处理血液，如下所述。
  4. 横断腔静脉/腹主动脉通过exsanquination安乐死
6. 冲洗肺血管系统（执行从肺循环中去除血液，因此测量处理的肺组织中的化合物仅反映来自不包括全身贡献的肺区室的值）：
  1. 使用镊子抓住xyphoid过程，穿刺隔膜用剪刀尖放气肺，并仔细切除隔膜的腹侧面（图16）。
    
    图16.切开的隔膜。用镊子抓住xyphoid过程，用剪刀尖穿刺隔膜，使肺缩小，并仔细切除隔膜的腹侧面（步骤B6a）。
  2. 继续沿胸骨和颈部纵向切开。
  3. 切开胸骨以暴露肺部（注意不要刺伤肺部）（图17）。
    
    图17.进行胸骨切开术。沿着胸骨和颈部继续纵向切口。切开胸骨以暴露肺（小心不要刺伤肺）（步骤B6b-c）。
  4. 用无齿镊握住心尖，并注射5mL（大鼠：20ml）1×具有Ca 2+ 2 +，Mg 2+（在37℃）的HBSS进入右心室（大鼠：20cc）注射器+ 26号针（图18），将它放置在心脏的左侧（因为动物在其背部）。注射速率应当足够快以保持心脏"充气"，但不能快到迫使流体通过注射部位流出。缓冲液中的钙及其在37℃，有助于心脏保持跳动，以便于冲洗肺血管系统。
    
    图18.冲洗肺脉管系统。用锯齿钳（组织钳具有撕裂心脏组织的倾向）抓紧心尖，并注射5ml 1x HBSS与Ca 2+ 2 + ，Mg 2+（在37℃）进入右心室（在该图中在心脏的左侧，因为动物在其背部）用5cc注射器+ 26号针头。注射速率应该足够快以保持心脏"充气"，但不能快到迫使流体通过注射部位流出（步骤B6d）。
7. 通过进行支气管肺泡灌洗（BAL）（进行以收集分泌到空间（即肺泡和支气管腔）中的细胞和化合物，可以评估它们以确定肺部炎症的程度（即，（TNF-α），白细胞介素-1β（IL-1β），IL-6，巨噬细胞炎症蛋白-2（MIP-2），嗜中性粒细胞，，单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1））和肺损伤（即总蛋白或白蛋白浓度）：
  1. 暴露气管和弯曲镊子的工作尖在它下面拉一条4"股1-0丝绸缝合线。
  2. 将23号x 1/2"（大鼠：14号，兔：3mm ID，4.5mm OD）不锈钢插管（兔：聚乙烯导管）插入气管并用缝合线固定（图19和20） br />
    
    图19.插入气管套管。按照损伤程序（步骤A6，A7和A9）中所述，将气管和弯曲镊子的工作尖暴露于其下，拉出1-0编织丝的4"股，使用20号针在上气管中制作一个洞，并在孔中插入一个23号1/2"不锈钢插管
    
    图20.固定气管套管。用缝线将套管固定在气管中（步骤B7a-b）。确保缝线紧紧，并在插入位点下面2-3 mm，以便进行良好的密封。插管尖端应在隆突前至少3mm（气管分叉）。如果1/2"套管插入喉部正下方，如图所示，套管尖端将处于正确的位置。
  3. 将连接灌洗装置（2个，5cc注射器连接到4路活塞）导管和缓慢，灌洗肺与5×1毫升（大鼠：10毫升，兔：50毫升）1 HBSS无Ca 2+ 2+/sup>， Mg 2+（在37℃）（图21和22）。缓冲液中缺乏钙有助于通过降低依从性来收获气道细胞
    
    图21.进行支气管肺泡灌洗（BAL）注射。将灌洗装置连接到套管，并缓慢注射1ml 1×HBSS与Ca 2+，Mg 2+，以硫化肺（步骤B7c）。
    
    图22.执行BAL收集。切换旋塞阀，并慢慢收集注射的灌洗液。重复注射和收集过程，共进行5次肺洗涤（步骤B7c）。
  4. 将收集的BAL液（BALF）分配到适当大小的管中，记录回收体积（通过称重），并置于冰上直到BALF处理，如下所述。
8. 收获肺（进行以评估不同于空气空间的肺炎症状态，即实质和间质组织）：
  1. 通过气管将肺，心脏和胸腺整合在一起（图23）。
    
    图23.收集肺，心脏和胸腺，。确定锁骨已切除。用手指抓住套管，气管和缝线，并用喉切开气管。当拉起和拉出时，工作剪刀背在肺下并扩展以脱离将肺和心脏连接到胸腔的组织。将需要切除结缔组织，以及食道和血管，以成功地集中肺，心脏和胸腺（步骤B8a）。
  2. 通过在肺门处切除肺叶主干支气管（图24和25），置于2ml冷冻管中并在液氮中快速冷冻除去肺叶。
    
    图24.收获肺叶。使用剪刀和镊子收集单个肺叶，以切除肺叶的主干支气管（步骤B8b）。
    
    图25.小鼠肺叶。从左侧顺时针：左肺叶，右肺 - 颅盖，右肺中叶，右肺尾叶，右肺 - 后腔静脉。 >
  3. 存储在-80°C，直到可以进行适当的处理，如下所述
血液处理
1. 等离子体
  1. 在4℃下以2,000xg离心4分钟。
  2. 用移液管取出血浆，分装到1.8ml微量离心管中
  3. 储存于-80℃。
2. 血清
  1. 在室温下孵育30分钟，然后在4℃过夜，以使凝块收缩
  2. 在4℃下以5,000xg离心15分钟。
  3. 用移液管取出血清，分装到1.8ml微量离心管中
  4. 储存于-80℃。
BALF处理（将样品保存在冰上）
1. 在4℃下，在1,500×g下旋转BALF 5分钟。
2. 在不干扰沉淀的情况下，用移液管收集上清液（留下50-100μl剩余体积的未收集的上清液以防止吸出细胞），并分配到等体积的等分试样在1.8ml微量离心管中（等分试样的数量和体积将取决于测定将被执行并且应该被设计为限制冻融循环的量）。储存于-80℃。
3. 在剩余体积中重悬沉淀。
4. 加入1ml氯化铵裂解缓冲液（37℃），孵育2分钟以裂解红细胞
5. 在12ml 75mm PS管中的4ml冰冷的2％BSA的PBS中的整个体积层
6. 在4℃下以150×g离心15分钟。
7. 吸出上清液（含细胞碎片和裂解红细胞），重悬沉淀的残余体积，并加入1ml PBS。通过将细胞离心通过2％BSA除去细胞碎片和裂解的红细胞使得细胞计数更容易和更准确。
8. 在血细胞计数器或库尔特计数器上计数细胞
9. 准备细胞离心片幻灯片用于微观观察：
  1. 将5×10 4个白细胞加入附于显微镜载玻片和滤纸卡的细胞离心漏斗（300μl总体积）中的PBS中的2％BSA中，并以28×g （500rpm）5分钟
  2. 取出载玻片并风干（重要：干燥时立即染色）。
  3. 用Diff Quik染色：
    1. 在固定剂，溶液I，溶液II（Diff-Quik试剂盒）中浸渍载玻片5×1秒，用H 2 O 风干。
    2. 安装幻灯片与小滴"Cytoseal 60"在细胞点上，放一个22 x 22毫米＃1.5盖玻片（确保没有气泡），并允许风干。
    3. 通过光学显微镜确定巨噬细胞，嗜中性粒细胞，淋巴细胞和嗜酸性粒细胞的百分比
肺处理（肺可以以多种不同的方式进行，取决于什么细胞区室（例如全肺匀浆，核部分，胞质部分，等）分子种类（例如蛋白质，mRNA，等），以及将利用什么测定技术（例如ELISA，Western印迹， PCR等）。该程序产生肺匀浆上清液，其可以通过ELISA测定各种细胞因子蛋白水平，以及从肺匀浆沉淀中提取髓过氧化物酶，可以测定酶促活性作为嗜中性粒细胞浸润的替代标记）
1. 解冻冷冻的肺并转移到能够耐受40,000×g的圆底离心机中。在加肺之前称重管，然后称重管+肺
2. 加入足够的细胞因子匀浆缓冲液，使肺+缓冲液的重量达到3g（大鼠：10g）。
3. 使用Polytron匀浆器在冰上均质化组织以防止样品的加热。用镊子取出均质器刀片中抓住的任何组织。用70％EtOH冲洗匀浆器，然后无菌 H 2 O
4. 在4℃下以40,000×g离心匀浆10分钟。
5. 将上清液分配到等体积的等分试样在1.8ml微量离心管中并储存在-80℃
6. 加入2 ml MPO缓冲液沉淀，并通过涡旋重悬
7. 存储在-80°C（在同一管），直到MPO提取可以执行
MPO提取程序
1. 在37℃水浴中快速解冻样品。
2. 超声处理1分钟，在冰上防止样品加热，在50％占空比的最大输出
3. 在55℃孵育2小时
4. 在4℃下以40,000×g离心15分钟。
5. 分配到0.5ml等分试样在1.8ml微量离心管中，并存储在-80℃下，直到MPO活动可以评估

食谱

100mg/ml小鼠（大鼠）胃颗粒
1. 早上从新鲜尸检鼠（大鼠）第一件事收获胃，并置于冰管50毫升。早晨收获保证胃饱满。
2. 在层流罩
  1. 把胃放在培养皿中，用剪刀纵向切开
  2. 将胃内容物放在干净的50ml离心管中
  3. 加入10ml无菌生理盐水（NS），并剧烈涡旋15秒
  4. 通过8层无菌纱布将颗粒悬浮液倒入烧杯中
  5. 使用额外的10ml无菌NS将管中的残留颗粒转移到纱布上
  6. 拧紧纱布收集吸收的液体。
  7. 将滤液转移到干净的50ml离心管中
3. 在4℃下以5,000xg离心5分钟旋转滤液
4. 弃去上清液，并重悬于25ml无菌NS中
5. 重复步骤1c& 1d。
6. 将颗粒悬浮液转移到锥形瓶中，121℃，121psi压力下30分钟（使用另外25ml，无菌NS转移残余颗粒）。
7. 将冷却的无菌颗粒悬浮液转移到预称重的50ml离心管中
8. 在4℃下以5,000xg离心5分钟旋转滤液
9. 在KIMWipe上倒置上清液和倒置的管以除去所有液体
10. 重新称量管+颗粒丸以确定颗粒湿重
11. 将无菌NS添加至100mg/ml（颗粒湿重/总体积）
12. 在4°C存储长达3周，直到用于受伤
酸伤溶液（酸）

生理盐水（NS），无菌
9.44 ml

1 N HCl，无菌
562微升

用无菌1N HCl调节pH = 1.25 新鲜
胃颗粒损伤溶液（部分）

生理盐水（NS），无菌
9 ml

100 mg/ml NS中的胃粒子
1ml（10mg/ml）

让新鲜。
酸+颗粒损伤溶液（酸+部分）

生理盐水（NS），无菌
8.44 ml

1N HCl，无菌
562微升

100 mg/ml NS中的胃粒子
1ml（10mg/ml）

用无菌1N HCl调节pH = 1.25 新鲜
磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.2

NaCl（58.44）
8g（137mM）

。 1.15g（8.1mM）

KCl（74.56）
200mg（2.7mM）

KH ₂ PO ₄（136.09）
200mg（1.5mM）

H <2> MQ 到1 L
调节pH = 7.2，过滤灭菌
在室温下贮存
氯化铵裂解缓冲液

NH 4 Cl（53.49）
4.13g（154mM）

KHCO ₃（100.1）
500毫克（10毫摩尔）

EDTA，四钠盐（380.2）
18.5mg（0.1mM）

彻底将粉末混合在一起
将等量分配到10,50ml离心管（0.46g /管）中使用当天，加入50ml H 2 O O MQ，并混合直至溶解
丢弃任何未使用的解决方案
肺匀浆缓冲液

NaCl（58.44）
8.77克（150毫摩尔）

Tris碱（121.14）
1.82g（15mM）

CHCl 2 2H O（147.02）
147毫克（1毫摩尔）

203mg（1mM）

H <2> MQ 到1 L
调节pH = 7.4，在121℃，15psi下高压灭菌15分钟
储存在4°C
在使用时，将100倍蛋白酶抑制剂混合物的1/100体积加入到一天处理所需的肺匀浆缓冲液体积中
50mM磷酸钾缓冲液，pH = 6.0

KH ₂ PO ₄（136.01）
3.4克（50mM）

H O _MQ到500ml
用2M NaOH调节pH = 6.0 在室温下贮存
MPO匀浆缓冲液

十六烷基三甲基溴化铵（364.5）
2克（0.5％）

EDTA（372.24）
744 mg（5 mM）

50mM磷酸钾缓冲液，pH = 6.0 400 ml

储存在室温下（不要冷藏）

致谢

这里提出的工作是由NIH授予HL048889，"Pathogenesis of Aspiration Pneumonitis"给Paul R Knight，M.D.，Ph.D. 和Bruce A. Davidson，Ph.D。要引用此协议，请同时使用以下参考文献：Davidson （2013）。

参考文献

鼠标模型

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Raghavendran，K.，Davidson，B.A.，Mullan，B.A.，Hutson，A.D.，Russo，T.A.，Manderscheid，P.A.，Woytash，J.A.，Holm，B.A.，Notter，R.H.and Knight，小鼠中酸和颗粒物诱发的肺损伤：MCP-1的重要性。 Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 289（1）：L134-143。
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