材料和试剂

缺乏β1整联蛋白（β1 -/- ）或重新表达野生型β1整联蛋白（β1重）的小鼠成纤维细胞
注意：这些细胞是来自floxedβ1亲本细胞的自制永生化小鼠成纤维细胞。 β1 -/- 细胞用作阴性对照。然而，该方案也可以转移到其他小鼠细胞系。当缺乏β1整联蛋白的细胞不可用作阴性对照时，必须包括不相关的抗体（参见步骤2和4）以监测非特异性结合。
含有GlutaMAX-I（Gibco，目录号：31966-021）的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）
胎牛血清（FBS）（PAA，目录号：A15-101）
PBS（Sigma-Aldrich，目录号：P4417）
0.5％胰蛋白酶/EDTA（Life Technologies，Gibco ，目录号：15400-054）
二磷酸伯氨喹（Sigma-Aldrich，目录号：160393）
蛋白G琼脂糖（Protein G sepharose Fast Flow）（Sigma-Aldrich，目录号：P3296）
BCA蛋白测定（Thermo Fisher Scientific，目录号：23227）
Triton X100
Tris-HCl
Na-脱氧胆酸盐
SDS
甘油
溴酚蓝
巯基乙醇
蛋白酶抑制剂（Complete Mini EDTA-free）（Roche，目录号：04 693 159 001）
磷酸酶抑制剂（磷酸酶抑制剂混合物2和3）（Sigma-Aldrich，目录号：P5726和P0044）
Talin-1抗体（1：1,000，用于western印迹）（Sigma-Aldrich，目录号：T3287）
SNX17抗体（用于western印迹的1：1,000）（Proteintech，目录号：10275-1-AP）
β1整合素IP缓冲液（参见配方）
2x Laemmli样品缓冲液（参见配方）

设备

细胞刮刀
10厘米细胞培养皿
离心机
37℃，5％CO 2细胞培养箱中培养
26-G针连接到1 ml注射器
加热块（Eppendorf Thermomixer compact或同等品）

程序

用PBS洗涤表达β1整合素（β1wt）的小鼠成纤维细胞和缺乏β1整合素（β1 -/- ）的成纤维细胞，胰蛋白酶消化并使用具有格栅的玻璃载玻片计数细胞。
对于两个细胞系板，每10cm皿2×10 6个细胞，并在37℃下在5％CO 2培养箱中的DMEM/10％FBS中孵育过夜。 br /> 注意：我们使用缺乏β1整合素的细胞系作为阴性对照。或者，可以将表达β1整联蛋白的细胞与无关的对照抗体一起温育（步骤4）。
将菜放在冰上，用冰冷的PBS（4ml /皿）洗两次
为了标记细胞表面β1整合素，将细胞在含有抗β1整联蛋白抗体或不相关抗体的3ml冰冷的DMEM/10％FBS中孵育作为阴性对照。
注意：抗β1整联蛋白抗体：抗体必须针对整联蛋白的胞外结构域中的表位，并且必须以其天然构象识别β1整联蛋白。我们使用针对小鼠β1整合素的自制抗体，浓度为1：1,500（Bottcher等，2012）。对于其他抗体，该量必须通过实验确定。
对照抗体：应来自与抗β1整联蛋白抗体相同的物种，并应以相同的浓度使用。
在4℃下将菜肴放在摇床上（每分钟约7次跷跷板运动），并孵育60分钟
将菜放在冰上，用冰冷的PBS（4ml /皿）洗两次选择性免疫沉淀细胞表面β1整合素继续步骤9.
为了从内体室免疫沉淀β1整合素，在37℃下将细胞在含有伯氨喹的DMEM/10％FBS中孵育15分钟。
注意：在冰上抗体与细胞表面β1整合素结合后，通过在37℃下孵育细胞可以诱导β1整合素内吞。这使得抗体-β1整联蛋白复合物能够到达内体区室。 β1整联蛋白被快速内化，并且伯氨喹的添加抑制β1整联蛋白从内体回到细胞表面的再循环，从而富集内体中β1整联蛋白的量。根据细胞类型，使用0.6μM至0.6mM的primaquine。
将盘放在冰上，用冰冷的PBS（4ml /皿）洗一次
溶解细胞在1mlβ1整合素IP缓冲液每10厘米培养皿在冰上15分钟
刮去细胞并将细胞裂解物转移到预冷却的1.5ml反应管中
用26号针短暂超声处理或通过几次。
在4℃下，以17,000×g离心10分钟，旋转细胞裂解物
将上清液转移到新鲜的预冷却的1.5ml反应管中
取出60微升全细胞裂解物样品和5.0微升以确定蛋白质浓度
取每30 mg蛋白G Sepharose浆液30.0μl，用β1整合素IP缓冲液洗涤三次，每个样品加入等量的细胞裂解上清液（每个样品使用1.0-1.5 mg细胞裂解液）。
在4℃下在摇摆平台或旋转器上孵育2小时
在4℃下以1500xg转动Eppendorf管2分钟。完全除去上清液，用500μl的β1整合素IP缓冲液洗珠子3-5次
最后一次洗涤后，取出上清液并通过在60μl2×Laemmli样品缓冲液中加热至90-100℃洗脱蛋白质7分钟。
在10,000×g下旋转30秒，收集上清液并加载到凝胶上。如果凝胶稍后运行，可以收集上清液样品并保持冷冻。
注意：β1整联蛋白翻译/加工是严格控制的逐步过程，其开始于88kDa多肽的合成，其在ER中（"未成熟"形式105kDa）和在高尔基体中经历连续糖基化不完全糖基化的β1整合素亚基和约125kDa的完全或"成熟"β1亚基。
可以通过用针对β1整联蛋白的抗体（例如用于免疫沉淀的抗体;稀释1:10,000）的western印迹显示细胞表面β1整联蛋白的成功的免疫沉淀。在免疫沉淀后，未成熟的105kDaβ1整联蛋白应该被强烈还原，理想地不可检测。为了进一步表征细胞表面β1整合素的纯度，可以通过蛋白质印迹分析沉淀物用于共免疫沉淀的蛋白质，例如talin-1（在质膜处与β1整联蛋白相互作用;对于蛋白质印迹为1:1,000）或SNX17与内体上的β1整合素相互作用; 1：1,000用于western印迹）。

食谱

β1整合素IP缓冲液
50mM Tris-HCl（pH7.5） 150mM NaCl 1％Triton X100
0.1％脱氧胆酸钠 1mM EDTA
蛋白酶抑制剂（Complete Mini EDTA-free; 1片用于10ml缓冲液）磷酸酶抑制剂（磷酸酶抑制剂混合物2和3;从库存稀释1：100）
2x Laemmli样品缓冲液
120 mM Tris-HCl（pH 6.8）
4％SDS
20％甘油 4mM EDTA
0.001％溴酚蓝
2％巯基乙醇

致谢

该协议改编自Böttcher等人的论文（2012）。我们感谢R.Fässler批判性地阅读手稿和持续的支持。这项工作由德意志交易所（SFB 914，项目A05）资助。

参考文献

Bottcher，R.T.，Stremmel，C.，Meves，A.，Meyer，H.，Widmaier，M.，Tseng，H.Y.and Fassler，R。（2012）。对nexin 17进行排序可以通过结合β1整合素尾部来防止β1整合素的溶酶体降解。 Nat Cell Biol 14（6）：584-592。