材料和试剂

人咽癌上皮细胞系Detroit 562（ATCC，目录号：CCL-138）
II型肺泡上皮细胞系A549（ATCC，目录号：CCL-185）
DMEM + GlutaMAX TM -I（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：31966-047）
胎牛血清（FCS）（Greiner Bio-One GmbH，目录号：758093S5403）
胰蛋白酶-EDTA（0.25％-1mM）（Life Technologies，目录号：25300-054）
脑心浸液（BHI）（Becton Dickinson and Company，目录号：237500）肉汤和BHI琼脂平板
抗生素：壮观霉素或卡那霉素（Merck KgaA，Calbiochem，目录号：567570-10和420311-5）
牛皮明胶（Sigma-Aldrich，目录号：G9382-100G）
甘油（Merck KgaA，目录号：1.04092.1000）
PBS（不含Ca 2+和Mg 2+）（Westburg BV，目录号：BE17-516F/12）。
皂苷（Sigma-Aldrich，目录号：47036-50G-F）

设备

24孔组织培养板（Falcon ，目录号：353407）
75cm 2培养瓶
离心机
CO <2>孵化器
台式孵化器

程序

人类咽上皮细胞系Detroit 562和II型肺泡上皮细胞系A549在37℃和5％CO 2下常规地生长在具有GlutaMAX TM sup-1和10％FCS的DMEM中。
为了通过或接种目的，将上皮细胞在10ml PBS中洗涤一次，并如下使用胰蛋白酶-EDTA分离：每75cm 2培养瓶加入3ml胰蛋白酶-EDTA，在37℃孵育5分钟和5％CO 2，直到细胞从底部分离，用7ml培养基收集细胞，计数细胞，在400×g下旋转所需量5分钟，重悬沉淀在所需体积的培养基中。
在粘附测定前两天，将2×10 5个底特律562细胞/孔接种到24孔组织培养板中，一天后，更新生长培养基。
将A549细胞在4×10 5个细胞的测定前一天接种到24孔组织培养板中。
对于两种细胞系，将每孔大约1×10 6个细胞的单层用于粘附测定。
M。卡那霉素菌株接种在脑心浸液（BHI）板（当需要时补充有抗生素）中，并在37℃下在含有5％CO 2的气氛中生长过夜。
从板中收获细菌并重悬于补充有0.15％明胶（PBS-G）的PBS中。
将该悬浮液用于接种BHI肉汤至〜550nm的OD 620nm，并在37℃下以200-250rpm生长，直到OD 620nm为1.0-1.2。随后，加入甘油至终浓度为20％，将1ml等分试样储存在-80℃。
在每次测定之前，将细菌在冰上解冻，在1ml含有GlutaMAX TM和1％FCS（感染培养基）的DMEM中洗涤一次，并在感染培养基中重悬浮至1×10 7 CFU ml ^-1。
上皮细胞用1ml PBS洗涤两次，用1ml的M感染。卡那霉素悬浮液（感染复数，每个细胞10个细菌），在200×g离心5分钟以促进细菌和细胞之间的接触，并在37℃下在5℃下孵育1小时％CO 2环境。
通过用1ml PBS洗涤3次（加入PBS，随后小心地吸出，不搅动）除去非粘附细菌。将底特律562或A549细胞分离并通过加入1ml 1％的皂甙在PBS-G中的溶液裂解，然后在37℃和5％CO 2中孵育。 10分钟。
通过在补充有合适的抗生素的BHI板上铺板10倍系列稀释物来计数CFU。突变体的粘附百分比计算为结合到底特律562细胞的接种物的分数。

致谢

该协议发表于：de Vries et al。（2013）。本研究得到了维也纳卓越奖（VSOE）资助（ID337956）的资助。

参考文献

de Vries，S.P.，Burghout，P.，Langereis，J.D.，Zomer，A.，Hermans，P.W.和Bootsma，H.J。（2013）。在铁限制条件下对粘膜炎莫拉氏菌生长的遗传学要求。 Mol Microbiol 87（1）：14-29。