材料和试剂

磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液（Sigma-Aldrich，目录号：P4417-100TAB）
30％w/w过氧化氢储备溶液（RICCA Chemical，目录号：3821.7-32）
硫代硫酸钠溶液（溶解于ddH 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：S8503）
菌株
25％Lennox肉汤（LB）培养基（Becton Dickinson and Company，Difco ^TM，目录号：240230）（参见Recipes）
LB琼脂平板（见Recipes）

设备

96孔板
标准培养皿
分光光度计（比色杯）（Thermo Fisher Scientific，型号：GENESYS 10S UV-Vis）
分光光度计（96孔板）（Bio-Rad Laboratories，型号：680）
用于OD <600> 读数的比色皿
摇床培养箱中，37℃，250rpm，
在37℃下静置培养箱
灭菌玻璃器皿：150 ml锥形瓶，盖上或箔片
无菌15 mm玻璃试管和塑料盖
无菌线环（用70％乙醇和火焰灭菌）

程序

第0天将来自冷冻库的条纹的绿脓杆菌细胞在LB琼脂位置上并在37℃静态过夜温育。
第1天。用无菌有线环从洋葱琼脂平板上挑取4-5个单菌落，并在150ml锥形瓶中接种15ml液体LB培养基。使液体细菌培养物在37℃下在250rpm振荡下生长16-18小时。
第2天。在具有1:100过夜细菌培养物的150ml烧瓶中接种15ml液体LB培养基。生长细胞在37℃下16-18小时，以250rpm振荡。
第3天。测定培养物的OD 600，并将细菌悬浮液稀释至约2.5×10 6个细胞/ml的起始浓度（总体积为1ml LB）。取决于所使用的细菌菌株，OD 600与CFU的比率将不同，并且需要对每种菌株确定：例如，对于PAO1野生型菌株，10 ⁸细胞/ml =〜OD 600 = 0.1
为了确认正确的起始细菌密度（〜2.5×10 6个细胞/ml），将100μl的上述细菌悬浮液等分到96孔板中。在PBS中以1:10的比例连续稀释细胞至约〜2.5×10 2个细胞/ml，然后在LB琼脂平板上平板100μl用于CFU计数。这也是时间零测量的CFU计数。
在无菌玻璃管中设置〜2.5×10 6个细胞/ml×1ml每个样品，每个条件每个菌株至少3个重复。对于H 2 O 2 O 2处理的样品，将H 2 O 2 O 2（1mM（2μl）加入到5μl mM（10μl）或其它所需的终浓度）。包括用PBS攻击的未处理对照。每个条件应至少进行三次重复。孵育细胞2小时，在250 rpm，37℃下摇动
在H 2 O 2 O 2或PBS攻击后，向所有样品中加入0.2％硫代硫酸钠以中和任何剩余的H 2 O 2 O 2，/sub>。即使当样品仅作为对照的PBS时，也添加。
为了测定H 2 O 2 Sub或PBS处理的样品中的活细胞计数，将100μl细菌样品等分成96孔板，连续稀释细胞1:10，然后板100μl每种稀释液在LB琼脂平板上用于CFU计数。将CFU计数板在37℃孵育过夜
第4天在LB琼脂平板上计数CFU，并基于所应用的稀释因子计算每个生物膜的活CFU。
通过比较PBS处理的条件和H 2 O 2 O 2处理条件中的活CFU计数来确定过氧化氢杀伤。

食谱

25％ LB培养基
5 g LB粉末培养基/L
溶于ddH 2 O中并高压灭菌
LB琼脂平板上含1.5％琼脂的LB培养基溶于ddH 2 O中并高压灭菌

致谢

我们要感谢CIHR（MOP-102727到DN）和Burroughs Wellcome基金（1006827.01到DN）的资金。该协议改编自以前发表的论文Khakimova等人（2013）。

参考文献

Khakimova，M.，Ahlgren，H. G.，Harrison，J. J.，English，A. M. and Nguyen，D.（2013）。严格的反应控制铜绿假单胞菌中的过氧化氢酶，是过氧化氢所必需的和抗生素耐受性。细菌 195（9）：2011-2020。