材料和试剂

磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液（Sigma-Aldrich，目录号：P4417-100TAB）
30％w/w过氧化氢溶液（未稀释，商业销售）（RICCA Chemical，目录号：3821.7-32）
硫代硫酸钠溶液（溶于ddH 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：S8503）
0.2μM聚碳酸酯25mm膜（通用电气公司，目录号：K02BP02500）
菌株
25％Lennox肉汤（LB）培养基（Becton Dickinson and Company，Difco ^TM，目录号：240230）（参见Recipes）
25％LB琼脂平板（见配方）

设备

6孔和96孔板
标准培养皿
分光光度计（比色杯）（Thermo Fisher Scientific，型号：GENESYS 10S UV-Vis）
分光光度计（96孔板）（Bio-Rad，型号：680）
用于OD <600> 读数的比色皿
在37℃，250rpm下振荡孵育器
在37℃下静置培养箱
无菌玻璃器皿：150 ml锥形瓶，盖上或箔片
1.5 ml和2 ml微量离心管
紫外线辐射源
无菌线环（用70％乙醇和火焰灭菌）
不锈钢钳（用70％乙醇和火焰灭菌）

程序

第0天将来自冷冻库的条纹的绿脓杆菌细胞在LB琼脂位置上并在37℃静态过夜温育。
第1天。用无菌有线环从洋葱琼脂平板上挑取4-5个单菌落，并在150ml锥形瓶中接种15ml液体LB培养基。生长液体细菌培养过夜16-18 小时，在250rpm振荡。
第2天。将聚碳酸酯膜轻轻地放置在新鲜无菌25％LB琼脂板的琼脂表面上，并通过将膜置于UV照射下1小时对膜进行灭菌。用无菌镊子小心处理膜，灭菌后立即使用膜。使用眼睛和皮肤的紫外线防护设备。每个条件每个条件使用至少3个膜进行足够的生物复制，并且可以在每个琼脂平板上放置多达6个膜。
测量过夜细菌培养物的OD 600，并将LB培养基中的细菌悬浮液稀释至10 8细胞/ml的起始浓度。取决于所使用的细菌菌株，OD 600与CFU的比率将不同，并且需要对每种菌株确定：例如，对于PAO1野生型菌株，10 ⁸细胞/ml =〜OD 600 = 0.1
点5μl（5×10 5个细胞）到无菌膜上，并允许液体被吸收（10-20分钟）。
孵育菌落生物膜在琼脂板上在37℃下24小时
第3天。使用无菌镊子，轻轻地将膜从琼脂表面上提起，并将它们（细胞侧向下）转移到每孔中装有2ml 25％LB液体培养基的6孔板中。确保膜扩散平面（不卷起），并且生物膜细胞保留在膜上
对于H 2 O 2 O 2处理的生物膜，向每个孔中加入30μlH 2 O 2 O 2（150mM）以每10分钟脉冲，持续30分钟（对于每次攻击的最终浓度为450mM H 2 O 2 2次）。进行脉冲以模拟细胞连续暴露于H 2 O 2 O 2。在H 2 O 2 O 2脉冲之间，在37℃温育细胞而不摇动。包括用PBS攻击的未处理对照。每个条件应至少进行三次重复。
在H 2 O 2 O 2或PBS攻击后，向所有样品中加入0.2％硫代硫酸钠以中和任何剩余的H 2 O 2 O 2，/sub>。即使当样品仅作为对照的PBS时，也添加。
为了测定H 2 O 2或PBS处理的生物膜中的活细胞计数，通过将膜和2ml液体从每个孔转移到2ml微量离心管中收集生物膜细胞。通过轻轻地举起并使用无菌镊子使膜滚动，使生物膜细胞面向内部。整个膜应浸没在液体中。确保膜传输之间的镊子消毒。在微量离心管中以最大速度涡旋生物膜至少1分钟以分离和重悬细胞。另外的上下移动和涡旋也可能是必要的，以确保在细菌悬浮液中没有可见的细胞团块。
等分100微升细菌悬浮液96孔板，连续稀释细胞1:10，然后板100微升的每个稀释在LB琼脂板上的CFU计数。将CFU计数板在37℃孵育过夜
第4天在LB琼脂平板上计数CFU，并基于所应用的稀释因子计算每个生物膜的活CFU。
通过比较PBS处理的条件和H 2 O 2 O 2处理条件中的活CFU计数来确定过氧化氢杀伤。

食谱

25％LB培养基
5 g LB粉末培养基/L
溶于ddH 2 O中并高压灭菌
25％LB琼脂平板上含1.5％琼脂的25％LB培养基溶解在ddH 2 O中并高压釜

致谢

我们要感谢CIHR（MOP-102727到DN）和Burroughs Wellcome基金（1006827.01到DN）的资金。该协议改编自以前发表的论文Khakimova等人（2013）。

参考文献

Khakimova，M.，Ahlgren，H. G.，Harrison，J. J.，English，A. M. and Nguyen，D.（2013）。严格的反应控制铜绿假单胞菌中的过氧化氢酶，是过氧化氢和抗生素耐受性所必需的。 195（9）：2011-2020。
Walters，M.C.，3rd，Roe，F.，Bugnicourt，A.，Franklin，M.J.and Stewart，P.S.（2003）。抗生素渗透，氧气限制，和低代谢活性对铜绿假单胞菌生物膜对环丙沙星和妥布霉素的耐受性。 Antimicrob Agents Chemother 47（1）：317-323。