材料和试剂

HEK 293T细胞
HeLa细胞
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Mediatech，Cellgro ，目录号：10-013-CV）
R9-ΔE质粒（Zhou和Aiken，2001），通过在野生型感染性R9克隆的包膜中引入移码突变而产生的HIV-1原病毒DNA克隆。由该克隆产生的病毒体是非感染性的，但可以制备通过用来自VSV或其他病毒的信封假型包装而感染）
pHCMV-G（VSV-G）质粒（来自逆转录病毒的质粒，其中逆转录病毒包膜糖蛋白被来自水泡性口炎病毒[VSV]的糖蛋白替换）。
p24 ELISA试剂盒（内部）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Mediatech，Cellgro ，目录号：21-0310-CV）
VSV-G-假型包膜缺陷型HIV-1（R9-ΔE）病毒颗粒
Efavirenz（NIH AIDS Research and Reference Reagent Program，Division of AIDS，NIAID，
NIH，目录号：11680）
DNase I（Roche，目录号：10104159001）
0.25％胰蛋白酶/2.21mM EDTA（Mediatech，Cellgro ，目录号：25-053-CI）
Triton X-100（Mallinckrodt，目录号：9002-93-1）
DNeasy血液和组织试剂盒（QIAGEN，目录号：69506）
cOmplete，Mini，无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物片剂（Roche，目录号：11836170001）
4至20％聚丙烯酰胺梯度Tris-甘氨酸凝胶（Bio-Rad）
硝化纤维素膜（General Electric Company）
小鼠单克隆抗GAPDH抗体（Santa Cruz，目录号：sc-47724）
小鼠单克隆抗LaminB1抗体（Life Technologies，目录号：33-2000）
SYBR green（ABI，目录号：4309155）
DpnI（New England Biolabs，目录号：R0176L）
DTT
酵母tRNA（Roche，目录号：10109541001）
正向引物MH531（5'-TGTGTGCCCGTCTGTTGTGT-3'）
反向引物MH532（5'-GAGTCCTGCGTCGAGAGAGC-3'）
DNase/RNase-free水
SDS-PAGE样品缓冲液
脱氧胆酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：30970）
N，N' - 双[2-羟乙基] -2-氨基乙磺酸（BES）（Sigma-Aldrich，目录号：B4554）
低密度缓冲区（参见配方）
放射免疫沉淀缓冲液（参见配方）
2x BES缓冲盐水（BBS）（参见Recipes）

设备

10厘米细胞培养皿
0.45-μm孔径注射器过滤器（Thermo Fisher Scientific，目录号：190-2545）
0.20-μm孔径注射器过滤器（Thermo Fisher Scientific，目录号：190-2520）
1.5 ml螺旋盖管
台式离心机（Thermo Fisher Scientific，Sorvall ）
台式冷冻离心机（Thermo Fisher Scientific）
Mx-3000p热循环仪（Stratagene）
CO <2>孵化器

程序

VSV-G假型包膜缺陷型HIV-1（R9-ΔE克隆）病毒颗粒的产生（Aiken，1998）
1. 在37℃，5％CO 2下，将293T细胞在含有10％v/v胎牛血清（FBS）和补充有抗生素[青霉素（100IU/ml）和链霉素（100μg/。
2. 借助0.25％胰蛋白酶/2.21mM EDTA从几乎汇合的培养皿中分离细胞，并在9ml培养基/100mm培养皿中种子2×10 6个细胞，并在37℃下孵育。
3. 次日使用磷酸钙-BBS方法（Chen和Okoyama，1987）转染293T细胞
  1. 在管中混合15μgR9-ΔE和5μgpHCMV-G（VSV-G）质粒。
  2. 向管中加入0.2μm过滤的水，使体积达到450μl
  3. 向管中加入50μl2.5M CaCl 2。
  4. 向管中滴加500μl的2×BBS
  5. 用移液管轻轻混匀几次
  6. 在室温下孵育试管20至30分钟。
  7. 将混合物加入到293T细胞中，轻轻涡旋并在35℃和3％CO 2下孵育细胞。
4. 从转染的皿中吸出培养基〜转染后16小时，用5ml PBS洗涤细胞，补充5ml新鲜细胞培养基，并在37℃，5％CO 2孵育。
5. 转染两天后，收获含有病毒颗粒的培养物上清液，以1500×g离心5分钟以沉淀细胞和碎片。
6. 通过0.45-μm孔径注射器过滤器过滤上清液，等分并在-80℃冷冻。
用VSV-G假型包膜缺陷型HIV-1感染HeLa细胞（R9-ΔE）
1. 在12孔板中以1.5×10 5个细胞/孔的密度铺板HeLa细胞（每孔1ml总培养物体积）。
2. 24小时后，用DNA酶I（20μg/ml）加上MgCl 2（10mM）处理病毒接种物，并在37℃的水浴中孵育1小时。
3. 用DNA酶I处理的接种物相当于15ng的p24（通过使用内部试剂盒的p24ELISA（Wehrly和Chesebro，1997）测定）感染细胞。
4. 在efavirenz（1μM）存在下进行平行感染，以确定转染后携带的残留质粒DNA水平。
5. 在37℃孵育感染细胞8小时注意：还可以通过在感染后以不同的时间间隔收获感染的细胞来分析逆转录的时间过程。
HIV-1感染的HeLa细胞的细胞分级分离
1. 孵育所需时间后，吸出培养基并用PBS洗涤细胞一次
2. 通过与500μl的0.25％胰蛋白酶-EDTA在37℃下温育2分钟来去除贴壁细胞。
3. 收集胰蛋白酶细胞在1.5毫升螺旋盖管。在300×g离心5分钟以沉淀细胞
4. 溶解细胞沉淀在200μl含有0.1％Triton-X-100的低渗缓冲液中，并在冰上孵育15分钟。
  注意：对HeLa细胞优化Triton-X-100的浓度。 Trition X-100的浓度代表在显微镜下计数的约95％的细胞具有完整细胞核但没有质膜的最低浓度。
5. 在4℃下以17,000×g离心5分钟，收集上清液作为细胞质级分。
6. 用1ml低渗缓冲液，无Triton-X-100三次洗涤核沉淀。在每次洗涤后，在4℃下以17,000×g离心5分钟以沉淀细胞核并吸出上清液。
7. 根据制造商的方案使用DNeasy血液和组织试剂盒分离核沉淀DNA。洗脱DNA在最后一步在新鲜的收集管使用100微升DNA酶/无RNA酶的水。洗脱的DNA可以储存在-80°C或直接用于执行qPCR
8. 平行地，从未感染的细胞制备全细胞，细胞质和核裂解物，以检查核级分的细胞质污染。
9. 为了制备全细胞裂解物，在放射免疫沉淀（RIPA）缓冲液中裂解细胞（遵循步骤C2-C5，除了使用RIPA缓冲液代替低渗缓冲液）。加入等体积的2x SDS-PAGE样品缓冲液进行凝胶电泳，并在95℃在加热块中加热5分钟。
10. 如上所述制备细胞质裂解物（步骤C2至C5）。加入等体积的2x SDS-PAGE样品缓冲液进行凝胶电泳，并在加热块中在95℃加热5分钟。
11. 为了制备核裂解物，遵循步骤C2至C6，然后在1x SDS-PAGE样品缓冲液中裂解核沉淀。在95℃在加热块中加热5分钟。在4-20％聚丙烯酰胺梯度Tris-甘氨酸凝胶上分离等体积的全细胞，细胞质和核裂解物。
12. 将解析的蛋白转移到硝酸纤维素膜上
13. 用PBS中的5％脱脂奶溶液和含有抗GAPDH和抗LaminB1抗体（制造商推荐的浓度）的探针以及随后的适当的第二抗体（制造商推荐的浓度）分别作为胞质和核标记物阻断膜。
SYBR基于绿色的定量PCR用于病毒逆转录产物的定量
1. 通过在37℃下孵育1至2小时，用DpnI（17μlDNA +2μl缓冲液+1μlDpnI-20单位）处理来自步骤C7的分离的DNA。通过在80℃下孵育20分钟来灭活DpnI
2. 病毒逆转录产物的定量
  1. 通过混合DNA（5μl），含有SYBR绿（12.5μl），正向引物（150nM），反向引物（150nM）和含有DNase/RNase-free水的tRNA（1μg/μl）的PCR混合物制备反应混合物至25μl
  2. 制备R9-ΔE质粒的10至10个拷贝/反应的标准物。标准品的稀释应在1μg/μl含tRNA的水中进行。
  3. 使用以下热曲线设置PCR反应：

食谱

低渗缓冲液
10 mM Tris pH 8.0
10 mM KCl
1.5mM MgCl 2·h/v 1 mM DTT
蛋白酶抑制剂混合物（每10ml缓冲液一片）
放射免疫沉淀缓冲液
50mM Tris pH7.5 1％Triton-X-100 250mM NaCl 5 mM EDTA
0.1％SDS
1％脱氧胆酸钠蛋白酶抑制剂混合物（每10ml缓冲液一片）
2x BES缓冲盐水（BBS）
50mM BES（N，N'-双[2-羟乙基] -2-氨基乙磺酸）
1.5mM Na 2 HPO 4
280 mM NaCl pH 6.95

致谢

该协议改编自Shah等人（2013）。该协议由NIH授权AI076121支持。

参考文献

Aiken，C。（1998）。 Nef和亲环蛋白的机制独立性增强人类免疫缺陷病毒1型感染性。 V 248（1）：139-147。
Chen，C.and Okayama，H。（1987）。哺乳动物细胞的高效转化质粒DNA。 Mol Cell Biol 7（8）：2745-2752
Shah，V.B.，Shi，J.，Hout，D.R.，Oztop，I.，Krishnan，L.，Ahn，J.，Shotwell，M.S.，Engelman，A.and Aiken，宿主蛋白质转运蛋白SR2/TNPO3和亲环素A对HIV-1去膜剂产生相反的作用。 a> J Virol 87（1）：422-432。
Wehrly，K。和Chesebro，B。（1997）。 p24抗原捕获测定法，用于使用易得的廉价试剂定量人类免疫缺陷病毒。 em> Methods 12（4）：288-293。
Yee，J.K.，Friedmann，T。和Burns，J.C。（1994）。生成具有非常宽的宿主范围的高滴度假型逆转录病毒载体。 Methods Cell Biol 43 Pt A：99-112。
Zhou，J.and Aiken，C。（2001）。 Nef增强人类免疫缺陷病毒1型感染性由病毒粒子融合产生的证据：病毒粒子包膜上支持Nef的作用的证据。病毒颗粒。 75（13）：5851-5859。