材料和试剂

细胞粗提取物
纯化蛋白或泛素活化酶粗提物（E1）
与蛋白质标签（例如6x His标签）融合的纯化的重组泛素偶联酶（E2）
纯化的重组泛素连接酶（E3）
纯化的泛素或与标签融合的重组泛素蛋白（< kraft 等人，2005; Liu等人，2010）
ATP（Sigma-Aldrich，目录号：A7699）
MgCl 2（Sigma-Aldrich，目录号：V900020）
抗遍在蛋白抗体或某种蛋白质标签的抗体
例如：
抗Ub，在我们的实验室提高
Anti-His（Santa Cruz，目录号：sc-0836）
Nickel-HRP（KPL，Kirkegaard& Perry Laboratories，目录号：24-01-01）
抗GST（北京蛋白质创新，目录号：AbM59001-2H5-PU）
抗MBP（New England Biolabs，目录号：E8030S）
直链淀粉树脂（New England Biolabs，目录号：E8021）
DTT
SDS-PAGE凝胶
Tris
PMSF
脱脂奶粉或BSA
化学发光HRP底物试剂盒（EMD Millipore，目录号：WBKLS0100）
甘油
溴酚蓝
MBP（麦芽糖结合蛋白）柱缓冲液（参见配方）
20x反应缓冲液（见配方）
4x SDS样品缓冲液，含或不含DTT（或β-巯基乙醇）（参见配方）
1x PBS（请参阅配方）

设备

离心机
热混合器（Eppendorf Thermomixer comfort）
蛋白电泳仪
Western印迹仪

程序

E2蛋白的DTT灵敏硫酯测定
1. 反应总共进行30μl，包括1.5μl20x缓冲液，50ng E1，200-500ng E2和2μg泛素。
2. 孵育反应在37℃下5分钟
3. 通过加入10μl含或不含DTT（或β-巯基乙醇）的4x SDS样品缓冲液分离反应物
4. 将样品在100℃下煮沸5分钟
5. 反应产物用12％SDS-PAGE凝胶分离，并通过用针对与E2蛋白融合的某些标签的抗ub抗体或抗体进行Western印迹来检测DTT敏感的硫酯键的形成。
  1. 将通过12％SDS-PAGE凝胶分离的样品蛋白质在100V下电印迹至硝酸纤维素膜75分钟。
  2. 用含有5％脱脂奶粉的1×PBS在室温下封闭膜1小时。
  3. 然后首先用第一抗体（建议的稀释比例：抗-Ub为1:5,000，抗His为1:500，抗MBP抗血清为1:500）然后用在含有3％胎牛血清的1×PBS中稀释的第二抗体脱脂牛奶在室温下1小时。在与初级和二级抗体温育后，用1x PBS洗涤膜两次（每次15分钟）。如果用镍-HRP检测His标记的蛋白，只需将膜与1：15,000稀释的镍-HRP在含有1％BSA的1×PBS中孵育1小时，洗涤膜两次，然后可以检测条带。
  4. 用Millipore化学发光HRP底物试剂盒检测条带。（图1）
    
    图1.His-UBC3的DTT敏感性硫酯测定（（Kraft等人，2005））。用抗His抗体检测反应样品。箭头表示DTT敏感的硫酯键。空心三角形表示E2蛋白本身的条带，其没有连接到Ub。星号表示带有His标签的Ub
E3蛋白的自身泛素化测定
E3蛋白可以在即将使用之前从细胞粗提取物的1.5-ml Eppendorf管中纯化（重组MBP（麦芽糖结合蛋白）-E3蛋白用作下面的实例）。
1. 涡旋并彻底悬浮直链淀粉珠
2. 等分100微升珠悬浮液到无菌微量离心管
3. 加入1ml MBP柱缓冲液，并重悬浮珠。
4. 在400×g离心2分钟，倾析上清液。重复清洗。
5. 向含有预洗珠子的管中加入0.5-1ml粗提取物（E3蛋白的总量应为0.5-1μg）。
6. 在室温下旋转1小时（或4℃，2小时）
7. 用1ml 50mM Tris-HCl（pH 7.5）洗涤珠子三次（如步骤B3-4），并使用非常薄的尖端除去最后一次洗涤的所有液体。
8. 准备反应总共30微升，包括1.5微升20x反应缓冲液，50纳克E1，200-500纳克E2和5微克泛素。将反应系统添加到含有与MBP-E3蛋白结合的直链淀粉树脂珠的管中。
9. 反应分别减去E1和负E2应与控制同时进行。
  1. 在30℃下在热混合器中搅拌（900rpm）孵育反应1.5小时
  2. 通过加入10μl4x SDS样品缓冲液（用DTT或β-巯基乙醇）分裂反应，并将样品在100℃煮沸5分钟。
  3. 反应产物用8-12％SDS-PAGE凝胶分离，用抗泛素抗体或抗体通过Western印迹检测与泛素或抗MBP抗体融合的某些标签的抗体。（参见步骤A5a-d）（图2）
    
    图2.MBP-SDIR1的E3连接酶自身遍在蛋白化活性（Zhang等人，2007）。
    ）。在E1（来自小麦），E2（UBCH5b）和6x His标记的遍在蛋白的存在下，测定MBP-SDIR1的E3活性。通过8％SDS-PAGE分离样品。使用镍 - 辣根过氧化物酶（镍-HRP）检测His标签遍在蛋白。
    注意：在此测定中，可以使用与相同E3组合的不同E2蛋白来研究E2/E3特异性。
E3 /底物泛素化测定
E3和底物蛋白应与不同的标签融合（标签也应与E1，E2和泛素融合的标签不同），重组蛋白应在使用前进行表达和纯化。蛋白质也可以通过体内表达来制备，例如本氏烟草中的农杆菌浸润。
1. 准备反应总共30微升，包括1.5微升20x反应缓冲液，50纳克E1，200纳克E2，200-500纳克E3，500纳克底物蛋白和5微克泛素。反应减去E1，减去E2（和减E3）应分别与控制同时进行
2. 在30°C孵育反应1.5小时
3. 通过加入10μl4x SDS样品缓冲液（用DTT或β-巯基乙醇）分裂反应，并将样品在100℃煮沸5分钟。
4. 反应产物用8-12％SDS-PAGE凝胶分离，并用抗泛素抗体或抗体通过Western印迹检测与底物蛋白融合的某些标签。（参见步骤A5a-d）（图3）
  
  图3.HY5-GFP（底物蛋白）被Myc-COP1（E3连接酶）泛素化（Zhao等人，2013）。 HY5-GFP和Myc-COP1都通过农杆菌浸润表达。然后，将细胞裂解物混合并用抗-Myc抗体免疫沉淀。将免疫沉淀产物用于进一步的体外泛素化测定。 E1（来自小麦），E2（UBCH5b）和6×His标记的泛素（Ub）。 ★代表多泛素化HY5-GFP和Myc-COP1的混合物。 ▲表示单泛素化E2。
  （a）通过用抗GFP抗体的免疫印迹检测体外泛素化样品。
  （b）通过用镍-HRP（或抗His抗体）的免疫印迹检测体外泛素化样品，以检测His-遍在蛋白。
  注意：在用作步骤B1-5之前，E3蛋白可以在来自细胞粗提物的1.5-ml Eppendorf管中纯化。然后在热混合器中用搅拌（900rpm）进行以下E3-底物泛素化反应。

食谱

MBP列缓冲区
20mM Tris-HCl（pH7.4） 0.2 M NaCl
1mM EDTA
在使用前加入1 mM DTT和1 mM PMSF
20x反应缓冲液
1M Tris pH 7.5
40 mM ATP
100mM MgCl 2/v/v 40 mM DTT
注意：等分并保存在-20°C。在使用前从-20°C取出等分试样，每个等分试样只能使用一次。
4x SDS样品缓冲液
0.2 M Tris pH 6.8
8％SDS
40％甘油 0.004％溴酚蓝
0.4M DTT（或20％β-巯基乙醇）没有DTT或β-巯基乙醇的缓冲液可以根据该配方制备
1x PBS
137 mM NaCl 2.7 mM KCl
10mM Na 2 HPO 4
2mM KH 2 PO 4 sub/
调整至pH 7.4

致谢

该协议从以下发表的文章开发： Zhao （2013）。这项工作得到中国国家基础研究计划（973计划）（2011CB915402）和中国国家科学基金会（CNSF 31030047/90717006）的资助。 Zhao QZ获得中国国家科学基金资助中心授予CNSF 31200907。

参考文献

Kraft，E.，Stone，S.L.，Ma，L.，Su，N.，Gao，Y.，Lau，O.S.，Deng，X.W.and Callis，J.（2005）。拟南芥的E2和RING型E3连接酶泛素化酶的基因组分析和功能表征。植物生理学 139（4）：1597-1611。
Liu，L.，Zhang，Y.，Tang，S.，Zhao，Q.，Zhang，Z.，Zhang，H.，Li，D.，Guo，H.and Xie，Q。（2010）。在本土烟草中通过农杆菌浸润检测蛋白质泛素化的有效系统。 Plant J 61（1）：893-533。
Zhang，Y.，Yang，C.，Li，Y.，Zheng，N.，Chen，H.，Zhao，Q.，Gao，T.，Guo，H.and Xie，Q。（2007）。 SDIR1是一种RING指E3连接酶，可以在拟南芥中积极调节应激反应性脱落酸信号。植物细胞 19（6）：1912-1929。
Zhao，Q.，Tian，M.，Li，Q.，Cui，F.，Liu，L.，Yin，B.and Xie，Q.（2013）。植物特异性体外泛素化分析系统。 Plant J 74（3）：524-533。