材料和试剂

293T细胞
DMEM + 10％NCS
抑肽酶（BBI Solutions，目录号：AD0153-50mg）
亮肽素（AMRESCO，目录号：J580-25MG）
胃蛋白酶抑制剂（AMRESCO，目录号：J583）
PMSF（Sangon Biotech，目录号：P0754-5g）
Tris-HCl（pH7.3）（Sangon Biotech）
250μg/ml Flag肽（在PBS缓冲液中）（GL Biochem，序列：DYKDDDDK）
丙酮酸（Sigma-Aldrich，目录号：80443）
NADH（Sigma-Aldrich，目录号：N8129）
Flag-beads（Sigma-Aldrich，目录号：M8823）
Lipofectamine 2000（Invitrogen）
反应缓冲液（参见配方）
0.3％NP-40缓冲液（裂解缓冲液）（见配方）

设备

F-4600荧光分光光度计
37℃，5％CO 2培养箱
90 mm细胞培养板

程序

制备LDH-A蛋白。你可以从ectopically过度表达和净化它从。或在293T细胞中异位表达Flag-LDH-A质粒，随后通过Flag-珠粒进行免疫沉淀并使用Flag肽洗脱。
293T细胞在37℃下在含5％CO 2的培养箱中的DMEM + 10％NCS中培养。使用Lipofectamine 2000或磷酸钙方法进行细胞转染。将2μg质粒转染到90mm平板的293T细胞中。转染后培养细胞30小时。
通过在4℃下轻轻摇动半小时，用蛋白质降解抑制剂通过0.3％NP-40缓冲液（裂解缓冲液）裂解细胞异位表达的Flag-LDH-A。
将细胞裂解物在4℃下离心15分钟（16,000×g），并将上清液与10μl（每90mm板的293T细胞）Flag-珠在4℃下通过旋转温育3小时慢慢
然后清洗旗形珠，并通过1ml 0.3％NP-40缓冲液在4℃下离心3分钟（400×g）3次，并与250μg/ml标志肽（200μl每90mm平板的293T细胞）摇动1小时，随后在16,000×g离心5分钟。将上清液用于酶活性检测
准备含有0.2M Tris-HCl（pH 7.3），30mM丙酮酸和6.6mM NADH的反应缓冲液。
对于每个反应，将10μlLDH-A酶溶液和290μl反应缓冲液加入到F-4600荧光分光光度计的量杯中，并检测在室温下由NADH氧化产生的吸光度（340nm）的荧光变化。
注意：反应系统可以根据您的LDH-A溶液浓度进行调整。反应非常快，请尽快检测变化。
反应后，软件将显示荧光变化的斜率，该值是该反应的速度

食谱

反应缓冲液
0.2 M Tris-HCl（pH 7.3）
30mM丙酮酸 6.6 mM NADH
0.3％NP-40缓冲液（裂解缓冲液） 50mM Tris-HCl（pH7.5） 150mM NaCl 0.3％Nonidet P-40
1μg/ml抑肽酶
1μg/ml亮肽素 1μg/ml胃酶抑素
1mM PMSF

致谢

该协议已经从先前发表的论文（等人（2013）中进行修改并且进一步详细描述。我们感谢复旦MCB实验室的成员在本研究中的讨论。我们还感谢李明伟博士的IEF测定。这项工作得到中国科学技术部973（批准号2009CB918401,2011CB910600），（批准号NCET-09-0315），NSFC（批准号No.31271454,81225016）和NSFC-NIH（批准号： 81110313）。这项工作还得到了中国教育部985计划，上海市教育委员会"黎明"上海市健康与学者100人才计划和上海市重点基础研究计划（12JC1401100）至Q.Y.L的支持。和NIH授权（Y.X.和K.L.G.）;和复旦大学医学院研究生明道项目基金（D.Z.）。这项工作致力于编写K5乙酰化抗体的振宇的记忆。

参考文献

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Koukourakis，M.I.，Giatromanolaki，A.，Sivridis，E.，Gatter，K.C.，Harris，A.L。和Tumor Angiogenesis Research，G.（2006）。乳酸脱氢酶5在可操作的结肠直肠癌中的表达：与存活和活化的血管内皮生长因子通路 - - 肿瘤血管生成研究小组的报告。 24（26）：4301-4308。
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