材料和试剂

U2OS或RG37细胞系
注意：U2OS是具有活性p53途径的骨肉瘤细胞，RG37是具有无活性p53途径的SV40永生化人成纤维细胞。存在具有设计用于测量同源性定向修复的底物的细胞。然而，可以使用插入了HDR基板的任何细胞系。
培养基（无血清培养基）
用于感兴趣的基因的siRNA（例如 rad51 ，其消耗降低了通过同源重组修复DNA DSB的效率）
质粒pcDNA3myc-NLS-I-SceI（编码由Puget等人（2005）制造的I-SceI）
INTERFERin转染试剂（Ozyme，目录号：POL409-10）
JetPEI转染试剂（Ozyme，目录号：POL101-10）
胰蛋白酶
甘油
SDS
β-巯基乙醇
溴酚蓝
Laemmli缓冲区（请参阅配方）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（参见配方）

设备

35 mm组织培养板
组织培养（例如37℃，5％CO 2培养箱）
流式细胞仪
Western印迹仪

程序

在下午结束时，每35mm直径的平板将100,000个细胞（U2OS或RG37）平板。在37℃，5％CO 2的细胞培养箱中在潮湿气氛中培养细胞。
让过夜。
使用INTERFERIN根据制造商的说明书用siRNA进行转染。使用10 nM siRNA混合在200μl无血清培养基与8μlINTERFERIN
24小时后，改变培养基并用编码I-SceI的质粒转染，以在含有I-SceI识别位点的GFP拷贝中诱导DNA双链断裂。每板使用1μg质粒。根据制造商的说明书，通过将1μgI-SceI质粒与200μlNaCl（150mM）与2μlJetPEI混合，使用JetPEI进行转染。
在第二天早上用PBS洗涤细胞并更换培养基
在质粒转染后孵育48小时
通过胰蛋白酶处理收获细胞
在两个管中分离细胞。使用一半细胞通过加入Laemmli缓冲液以通过Western印迹检查siRNA效应和I-SceI表达来制备细胞提取物。
用PBS洗涤另一半的细胞。
重悬于PBS中，通过流式细胞术分析以检测GFP阳性细胞。 GFP阳性细胞代表其中在I-SceI位点诱导的DNA双链断裂已经通过同源重组修复的细胞群体。通过检查每个条件至少25,000个事件进行量化。
注意：首先，作为阴性对照，使用未用I-SceI质粒转染的细胞，以便定义检测阴性细胞用于GFP表达的窗口。然后，使用用I-SceI质粒转染的细胞样品以获得GFP阳性细胞亚群，其是通过同源重组修复的DNA断裂的细胞（图1）。

图1.FACS获得的实施例。左图，大多数细胞是GFP阴性，仅0.06％是GFP阳性。右图，用I-SceI质粒转染的细胞，我们观察到在R3区域存在1.8％的GFP阳性细胞群的出现。

食谱

Laemmli缓冲区
Tris HCl pH 6.8（60mM） 10％甘油 2％SDS
5％β-巯基乙醇 0.01％溴酚蓝
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
135 mM NaCl 2.5mM KCl
10mM Na 2 HPO 4
1.75mM KH 2 PO 4 sub/

致谢

该协议改编自Dumay等人（2006）和Puget等人（2005）的先前作品。我们承认使用Toulouse Rio Imaging设备进行流式细胞术分析。这项工作得到了Ligue Nationale Contrele癌症（D. Trouche;équipelabellisée），癌症研究协会（ARC）作为一个计划ARC，国家民众协会（Projet 2011 blanc SVSE8 PinGs），以及法国电力公司（Y. Canitrot）。

参考文献

Courilleau，C.，Chailleux，C.，Jauneau，A.，Grimal，F.，Briois，S.，Boutet-Robinet，E.，Boudsocq，F.，Trouche，D。和Canitrot，染色质重塑p400 ATP酶促进Rad51介导的DNA双链断裂修复。 J Cell Biol 199（7）：1067-1081
Dumay，A.，Laulier，C.，Bertrand，P.，Saintigny，Y.，Lebrun，F.，Vayssiere，J.L.and Lopez，B.S。（2006）。 Bax和Bid，两个促细胞凋亡Bcl-2家族成员，抑制同源重组，独立于凋亡调节。 Oncogene 25（22）：3196-3205。
Puget，N.，Knowlton，M。和Scully，R。（2005）。哺乳动物细胞中姐妹染色单体重组的分子分析 DNA修复） 4（2）：149-161。