材料和试剂

小鼠13-14天怀孕
没有Ca 2+和Mg 2+的磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：10010）
含有4.5g/L D-葡萄糖（ Life Technologies，Gibco ，目录号：11960044或Mediatech，目录号：15-017-CV） />
胎牛血清（Atlanta Biologicals，目录号：S11550）
L-谷氨酰胺（Life Technologies，Gibco ，目录号：25030-149）
1×青霉素 - 链霉素溶液（Gibco，目录号：15140-148）
0.25％胰蛋白酶-EDTA（Life Technologies，Gibco ，目录号：25200）
70％乙醇
注意：在无菌容器中用无菌蒸馏水配制。
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D8418）
具有10％胎牛血清的MEF培养基（参见Recipes）

设备

塑料解剖板或吸墨纸厚垫（如Schleicher和Schuell GB004纸）
遮蔽胶带或推针
无菌精剪刀（至少3件）
无菌精钳（至少3枚）
无菌4 x 4纱布垫（医疗用品供应商提供）
无菌手术刀刀片或单刃剃刀刀片
考试手套
培养皿（100mm）（BD Biosciences，Falcon ，目录号：351029或等同物）
无菌塑料血清移液管，5和10 ml
无菌一次性管（50ml）（BD Biosciences，Falcon ，目录号：352070或等同物）
T75组织培养瓶（Corning，目录号：430641或等价物）
37℃，5％CO 2组织培养箱
组织培养罩
倒置显微镜
冷冻瓶（例如Nunc ^®，目录号：375418）

程序

收获胚胎从雌性小鼠出现后13-14天的交配塞。在这个阶段，女性应该明显怀孕。
注意：根据特定菌株的生存力，可以预期每个怀孕女性有6-10个胚胎，并且对于几个实验应该产生足够的MEF。
安乐死怀孕女性颈椎脱位（这可以在台面上，组织文化罩外）。将鼠标放在解剖板上或厚垫的吸墨纸上
用70％乙醇彻底浸泡小鼠的毛皮。用鼠标将板或垫转移到组织培养罩
用剪刀剪切皮肤，然后用双手抓住皮肤，拉开露出腹壁。使用胶带（或针）将鼠标的脚连接到电路板（或焊盘）。
将10ml的0.25％胰蛋白酶-EDTA放入一个覆盖的培养皿中，并在另一个培养皿中放入约20ml PBS。
放置用来剪毛皮的剪刀，戴上一副新的手套。用新的剪刀，穿过腹壁。使用镊子提起子宫角，并用剪刀切掉子宫。小心不要让子宫接触毛皮。将子宫置于带有PBS的培养皿中。
注意：不使用时，可以将剪刀和镊子放在倒置的培养皿盖中，然后用用70％乙醇润湿的纱布垫擦拭即可清洁。
通过切片通过子宫在每个胚胎之间的区域分离胚胎。胚胎可以自发弹出，或者用镊子轻轻按压后出来。如果他们不容易出来，从暗红色，盘状胎盘所在的位置开始仔细切除子宫组织。如果胚胎仍在卵黄囊中，用镊子轻轻拉出囊。
转移胚胎到一个新的菜用PBS - 使用一个新鲜的PBS每3个胚胎。旋转菜，以从胚胎中移除血液。
用一只手，用镊子拿起一个胚胎，另一只手，切断眼睛上方的头。使用另一对镊子撕掉红色组织（心脏和肝脏）。将其余的胚胎在覆盖的培养皿中用0.25％胰蛋白酶-EDTA
在所有胚胎被分离并且用胰蛋白酶放置在培养皿中后，用剪刀剪下胚胎，然后使用解剖刀刀片或剃刀刀片将组织切碎成1-2mm的碎片。用10ml移液管上下吸移数次，然后将培养皿置于37℃组织培养箱中10分钟。
从培养箱中取出培养皿，用5ml移液管吸取胚胎片上下数次。将培养皿放回培养箱中5-10分钟。
转移细胞悬浮液到50ml管。加入20毫升MEF培养基（见下文配方）灭活胰蛋白酶，并用移液管上下数次。让细胞悬浮液静置约5分钟，使更大的胚胎碎片沉到管底部
将由单细胞和细胞簇组成的上清液转移到T75烧瓶中。每个烧瓶应该接受相当于3个胚胎的细胞悬浮液的体积。添加MEF培养基到烧瓶中，使总体积为15-20毫升。
注意：如果发生了一些细胞裂解，细胞悬浮液可能是粘稠的，并且可能不能避免将较大的片段转移到烧瓶中。这不是一个主要问题，因为一些成纤维细胞将从组织碎片迁移出来并附着在培养皿上。
第二天早晨，取出旧的培养基（有死细胞和碎片），并更换新鲜培养基。检查细胞当天晚些时候;如果培养物非常致密，分成3个T75烧瓶。否则，在第二天或当它们达到汇合时拆分单元格。这是段落数1.
当细胞汇合时，通过胰蛋白酶消化收获，离心，并将细胞沉淀物重悬在冷冻培养基（具有10％胎牛血清和10％DMSO的MEF培养基）中。将MEFs等分到冷冻管中，并使用哺乳动物细胞冷冻保存的标准方法冷冻细胞。
注意：一些方案需要在冷冻培养基中20％胎牛血清，但10％已经为我们工作。
如果以低密度电镀，MEFs将更快地衰减。由于细胞的生长在几次传代后开始减慢，每个传代每个烧瓶中转移的细胞数目应该增加。
大约10代后，当细胞增殖大大降低时，MEF将达到危机阶段。永生化品系可以通过遵循Todaro和Green的方案（Todaro和Green，1963）在几周内得到。我们已经发现，在收集盘或烧瓶中的所有细胞并且每5天重新在新鲜培养基中传代约18次后可以获得永生化MEF细胞系。

食谱

具有10％胎牛血清的MEF培养基将450ml DMEM与50ml胎牛血清混合 5ml 200mM L-谷氨酰胺 5ml 100x青霉素 - 链霉素溶液

致谢

该方案基于Todaro和Green（1963）的方法和该技术的后续修改，如在例如Coats等人（1999）的出版物中所描述的。这项工作是由国家癌症研究所，国立卫生研究院癌症研究中心的校内研究计划支持。

参考文献

Coats，S.，Whyte，P.，Fero，ML，Lacy，S.，Chung，G.，Randel，E.，Firpo，E.and Roberts，JM（1999）。在p27（Kip1）缺陷型细胞中揭示的促分裂原依赖性cdk2调节的新途径 Curr Biol em> 9（4）：163-173。

Qian，X.，Durkin，M.E.，Wang，D.，Tripathi，B.K.，Olson，L.，Yang，X.Y.，Vass，W.C.，Popescu，N.C。和Lowy，D.R。 dlc1基因的失活与 p15 基因的下调协同作用，/em> ^INK4b和 p16 ^Ink4a，导致肿瘤转化和预后不良在人癌症中。 Cancer Res 72（22）：5900-5911。

Todaro，G.J.and Green，H。（1963）。对培养中小鼠胚胎细胞生长的定量研究及其发展成为已确立的。 J Cell Biol 17：299-313。