材料和试剂

设备

程序

取出培养基，用PBS洗涤细胞3次，用破碎缓冲液（BB）洗涤1次。
通过刮擦和沉淀细胞来收获细胞（例如以300×g/5分钟，5分钟）。
在300×g /分钟，5分钟的PBS离心细胞中洗涤沉淀2次
在冰冷的BB中洗涤1次。
在冰冷的BB中将沉淀物1：5稀释
在冰上用EMBL细胞破碎器20x匀浆沉淀注意：确保均质化过程中没有气泡。
混合几个匀浆与台盼蓝溶液在载玻片上，盖上盖玻片。用显微镜检查匀浆注意：质膜不应该是完整的。细胞核应用台盼蓝染蓝色。在匀浆中应该有很多膜片段和颗粒，但是核应该保持完整。
将匀浆与62％蔗糖混合
1. 2ml匀浆
2. 1.83ml 62％冰冷的蔗糖
3. 41.7μl的100mM EDTA（pH7.4）
用折射计检查蔗糖浓度为37％+/- 0.5％蔗糖梯度：溶液w/w％检查溶解蔗糖后溶液的pH值
运行渐变
1. 4ml匀浆（在37％蔗糖中）
2. 4.5ml 35％蔗糖
3. 3.5ml 29％蔗糖（至顶部）
注意：在底部均化，然后加入35％蔗糖，然后加入29％蔗糖。
离心：SW 40 Ti Rotor，在4℃以最大速度离心1.5小时（ x g ）。
使用1ml注射器用20/21G针头（高尔基带位于35％/29％蔗糖相间）将0.4ml中的高尔基体带拉出。
测量蛋白质浓度并且功能性高尔基体膜现在可以在液体N 2中快速冷冻并储存在-80℃。

笔记

避免盐/离子在匀浆中，因为它可能聚集细胞器
加入大量蔗糖会影响pH值
不要在步骤6中过多匀浆，因为细胞器可能破坏
1. 蛋白酶可以从溶酶体中漏出。
2. 破碎的细胞器可以与其他破碎的细胞器重新密封。
3. DNA可以从细胞核释放，使样品粘性
分离的高尔基膜在含有约30％蔗糖的缓冲液中。因此，如果高尔基体膜需要沉淀用于进一步分析，则需要通过加入3体积的合适的缓冲液如PBS来稀释蔗糖。

食谱

致谢

该方案改编自Balch等人公布的原始版本（1984）。

参考文献

Balch，W.E.，Dunphy，W.G.，Braell，W.A.and Rothman，J.E。（1984）。通过偶联的N-乙酰葡萄糖胺的结合测量，重建高尔基体的连续区室之间的蛋白质运输。 Cell 39（2）：405-416。
von Blume，J.，Alleaume，A.-M.，Kienzle，C.，Carreras-Sureda，A.，Valverde，M.and Malhotra，V.（2012）。 Cab45是Ca ^{2 +}依赖分泌货物分拣所需的 trans-Golgi network。 J Cell Biol 199（7）：1057-1066。