材料和试剂

氯仿（Carl Roth，目录号：7331.2）
七七烷（Fluka，目录号：51848）
Dotriacontane（Fluka，目录号：44253）
N，O-双 - 三甲基甲硅烷基 - 三氟乙酰胺（BSTFA）（Macherey-Nagel，目录号：701220.201）
吡啶（Merck，目录号：1074630500）
1.25M甲醇-HCl（Fluka，目录号：17935）
氯化钠饱和水溶液（Applichem，目录号：A2824）
无水硫酸钠盐（Applichem，目录号：A1048）
果胶酶（Trenolin Super D）（Erbsloh，目录号：20312）
纤维素酶（Cellulast）（Novo Nordisk AIS，目录号：CA451088）
柠檬酸一水合物（Sigma-Aldrich，目录号：C1909）
液氮
20mM柠檬酸盐缓冲液，pH 3.0，补充有1mM叠氮化钠（参见Recipes）

设备

冷冻干燥器
氮气瓶和排污系统
带玻璃闪烁瓶支架的块式加热器
玻璃闪烁瓶（体积15-20ml）
具有锥形底部（体积为1-1.5ml）的玻璃小瓶
玻璃小瓶（体积1.5ml）和用于它们的玻璃插入物（体积0.2ml）
玻璃漏斗和玻璃巴斯德吸管
带玻璃瓶的聚四氟乙烯或PTFE衬垫的螺旋盖
玻璃注射器（体积为1,000,100,50和10μl）
滤纸
尼龙过滤器（孔41μm）（EMD Millipore，型号：NY4102500）
玻璃过滤装置
GC-MS：具有柱上进样（J& W Scientific; 30m DB-1,320μmid，d f = 1mm）的温控毛细管气相色谱仪（Agilent Technologies，型号：6890N））和质谱检测器（Agilent Technologies，型号：5973N; 70eV; m/z 50-750）。
GC-FID：毛细管气相色谱（Hewlett-Packard，型号：5890 II）和火焰离子化检测

程序

蜡分析
1. 花的叶子。 MicroTom在开花期收集并在液氮中冷冻。将植物材料冷冻干燥过夜。
2. 将约10至30mg冷冻干燥材料浸没在含有3mg三十七烷（内标物）的10ml氯仿的15ml容器中1分钟，然后通过滤纸过滤。
3. 将滤液在氮气流下蒸发至体积1ml，并转移至具有圆锥形底部和1-1.5ml体积的玻璃小瓶中。溶剂在氮气流下完全蒸发
4. 使用10μlBSTFA和10μl吡啶将含羟基的化合物转化成相应的三甲基甲硅烷基衍生物。将混合物在70℃温育30分钟，然后溶于50-100μl氯仿中
5. 将溶液转移到玻璃插入物中，将玻璃插入物放置在体积为1.5ml的玻璃小瓶中
6. 通过温度控制的毛细管气相色谱和柱上注射，用氦载气入口压力在50kPa下编程5分钟，3.0kPa min -1 -1至150kPa和150kPa 40分钟。蜡混合物的分离使用50℃的初始温度2分钟，以40℃min升高至200℃，在200℃保持2分钟，然后升高3℃min -1至320℃并在320℃保持30min。这些参数对于表皮蜡的分析是通用的，并且允许来自不同植物物种的样品的良好峰分辨率。根据其从市售和国内图书馆获得的保留时间和质谱来鉴定单个化合物
7. 在与上述相同的气相色谱条件下，用氢气作为载气，使用毛细管气相色谱和火焰离子化检测来研究混合物的定量组成。单一化合物针对庚三十烷定量。蜡装载量计算为冻干花的干重
Cutin分析
1. 对于角质分析，使用冷冻干燥的材料（a）或酶分离的角质层（b）。
  1. 在室温下用氯仿短暂洗涤约25mg冷冻干燥的花，然后在50℃下用新的氯仿部分洗涤30分钟。然后将样品在氯仿中每天更换（在室温下）孵育一周。将无蜡材料风干并储存在二氧化硅上
  2. 用补充有叠氮化钠的柠檬酸盐缓冲液中的果胶酶和纤维素酶促分离来自鲜花的角质层。材料在酶溶液中孵育4周，偶尔摇动。每周材料在尼龙过滤器上收集，然后更换为新鲜部分的酶溶液。用水洗涤分离的角质层，并在空气流下干燥。然后用氯仿将角质层脱脂，再次风干
2. 随后的角质单体的分离和它们的分析对于两种类型的样品没有区别。干燥的样品用1ml的1.25M甲醇/HCl在80℃下酯交换过夜，以释放角质酸单体和酚类的甲酯。
3. 然后，向反应混合物中加入1ml氯化钠饱和水溶液，2ml氯仿和20μg三十二烷（内标）。所有组分通过摇动混合，然后允许分离成两相
4. 用氯仿和解聚的转甲基化角质组分代表的下相用玻璃注射器收集并转移到玻璃小瓶中。
5. 将新的2ml氯仿加入到反应混合物中。所有组分通过摇动混合，然后允许分离成两相
6. 用玻璃注射器再次收集下相，并与步骤11的提取物合并
7. 将新的2ml氯仿加入到反应混合物中。所有组分通过摇动混合，然后允许分离成两相
8. 用玻璃注射器再次收集下相，并与步骤11的提取物合并。因此，提取进行三次。
9. 合并的有机相用无水硫酸钠干燥。为此，将盐以小份加入溶液中，直到盐停止聚集。所需的量取决于溶剂溶液中的水的量，并且其根据实验变化。溶液应该干燥，直到盐晶体游离为止。
10. 通过滤纸过滤该溶液以除去盐，并在连续氮气流下蒸发有机溶剂
11. 将含羟基的化合物转化成相应的三甲基甲硅烷基衍生物如蜡，然后溶于250μl氯仿中
12. 将溶液转移到玻璃插入物中，将玻璃插入物放置在体积为1.5ml的玻璃小瓶中
13. 使用相同的设备，但是不同的条件进行角质组分的GC-MS和GC-FID。在50kPa下编程60分钟，10.0kPa min -1至150kPa的入口压力。初始温度为50℃，持续2分钟，以10℃/min升至150℃，在150℃下保持2分钟，然后升高3℃min。 -1至320℃，并在320℃保持30分钟。单一化合物针对三十二烷定量。计算所述角质组分的相对比例，作为分离的无蜡角质层的干重。计算定量的角质组成，计算为脱脂冻干花的干重

食谱

20mM柠檬酸盐缓冲液，pH 3.0，补充有1mM叠氮化钠 2,000毫升蒸馏水
20ml Cellulast（纤维素酶）
20ml Trenolin Super D（果胶酶）
0.13克叠氮化钠在室温下贮存

致谢

该报告是对早期公开的用于营养器官中角质层的化学分析开发的方案的改编（Leide等人，2007）。

参考文献

Leide，J.，Hildebrandt，U.，Reussing，K.，Riederer，M。和Vogg，G。（2007）。番茄果实蜡堆积的发育模式及其对表皮蒸腾屏障特性的影响：缺陷的影响在β-酮脂酰辅酶A合酶（LeCER6）中。植物生理学144（3）：1667-1679。
Smirnova，A.，Leide，J.和Riederer，M。（2013）。在非常长链脂肪酸β-酮脂酰辅酶缺乏番茄合成酶损害微粒形成并导致花器官融合。植物生理 161（1）：196-209。