材料和试剂

骨髓细胞细胞系MNNG/HOS＃来自中国科学院细胞库（中国上海）
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham（DF）（Sigma-Aldrich，目录号：D8900）
胎牛血清（FBS）（Hyclone，目录号：GUC SH30084）
NaCl（Wako Chemicals USA，目录号：191-01665）
KCl（Wako Chemicals USA，目录号：163-03545）
Na 2 HPO 4（Wako Chemicals USA，目录号：197-02865）
（Wako Chemicals USA，目录号：169-04245）。
胰蛋白酶（0.05％）（Sigma-Aldrich，目录号：T4799）
EDTA（0.04％）（Sigma-Aldrich，目录号：E6758）
胰蛋白酶抑制剂（0.05％）（Sigma-Aldrich，目录号：T9128）
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay kit（Promega Corporation，目录号：G3582）
顺铂（Sigma-Aldrich，目录号：P4394）
阿霉素（Sigma-Aldrich，目录号：D1515）
琼脂糖（Sigma-Aldrich，目录号：A9539）
I型胶原（Life Technologies，Gibco ，目录号：17100-017）
胶原酶I（Sigma-Aldrich，目录号：C3867）
胶原酶IV（Life Technologies，Gibco ，目录号：17104-019）
胰岛素（Sigma-Aldrich，目录号：I5500）
Apo-Transferrin（Sigma-Aldrich，目录号：T2252）
2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M7522）
乙醇胺（Sigma-Aldrich，目录号：E0135）
亚硒酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S5261）
BSA（Sigma-Aldrich，目录号：A6003）
油酸（Sigma-Aldrich，目录号：O1383）
肝素（Sigma-Aldrich，目录号：H3149）
L-抗坏血酸2-磷酸三钠盐（Wako Chemicals USA，目录号：323-44822）
Milli Q水
TGF-β1信号传导抑制剂SB431542（Biovision，目录号：1674-1）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D5879）
PBS无Ca ^{2 +}和Mg ^{2 +}（参见配方）
无血清培养基（见配方）
癌干细胞培养基（见配方）

设备

离心机（Thermo Heraeus Megafuge 1.0）
CO 2细胞培养箱（NuAire，型号：nu8700E）
显微镜（Nikon corporation Japan，型号：Nikon Eclipse Ti-U）
微量板阅读器680（Bio-Rad Laboratories，型号：168-1001）
Coulter计数器（Beckman Coulter，型号：Z1）
体积可调微量移液管（Gilson1-10μl，型号：FA10002M;10-100μl，型号：FA10004M;100-1,000μl，型号：FM10006M）
多通道移液器（BIOHIT mline pipettor，型号：725140）
10ml玻璃移液管（BrandTech，型号：27713）
电动移液器（BrandTech，型号：accu-jet pro 2026330）
96孔培养板（Greiner Bio-One GmbH，目录号：655180）
24孔板（Greiner Bio-One GmbH，目录号：665180）
50ml离心管

程序

对于96孔板中血清培养的单层细胞
1. 在补充有10％FBS的DF培养基中保持单层细胞的原种培养物（图1）
2. 用补充有5％FBS的DF培养基调节细胞密度为50,000细胞/ml
3. 在96孔板中分配100μl细胞悬浮液（50,000个细胞/ml）。
4. 孵育细胞在潮湿的孵化器（37°C，5％CO 2）24小时。
5. 向含有细胞的96孔测定板的每个孔中加入1μl不同浓度的阿霉素或顺铂，并水平摇动96孔板以混合药物（不需要更换培养基）。
6. 在潮湿的培养箱（37°C，5％CO 2）中孵育细胞72小时。
7. 解冻CellTiter 96 ^® AQueous One溶液试剂。在室温下需要约90分钟，或在37℃的水浴中10分钟，以完全解冻20毫升大小。
8. 吸取20μl的CellTiter 96 AQueous One溶液试剂到96孔测定板的每个孔中，其含有在100μl培养基中的细胞，并水平摇动96孔板以混合试剂（不需要更换介质）。
9. 在37℃在潮湿的培养箱（37℃，5％CO 2）中孵育平板2小时。
10. 使用Microplate Reader 680记录490nm处的吸光度
对于24孔板中的无血清培养的单层细胞
1. 24孔板的制备：
  1. 用冷却的1×PBS制备1％I型胶原溶液。
  2. 向24孔板的每个孔中加入0.5ml胶原溶液
  3. 将24孔板在室温下放置1小时。
  4. 吸出过量的胶原蛋白溶液，并用1×PBS清洗一次。
  5. 完全吸出1×PBS
2. 在补充有10％FBS的DF培养基中维持单层细胞的原种培养物
3. 当单层细胞为80〜90％汇合时，弃去培养基并在2ml 1×PBS中洗涤细胞一次
4. 用1ml胰蛋白酶-EDTA在37℃消化细胞2-5分钟。
5. 在显微镜下检查细胞状态。当细胞分离时，用相同体积的胰蛋白酶抑制剂终止消化反应
6. 吸取细胞到50ml离心管，并收集细胞通过在800 rpm离心5分钟。
7. 通过没有抗生素的DF培养基悬浮细胞沉淀。用于化学抗性测定的DF培养基是不含抗生素的。
8. 通过Coulter计数器计数细胞。
9. 用无血清DF培养基调节细胞密度为20,000/ml
10. 向24孔板的每个孔中加入1ml细胞溶液
11. 孵育细胞24小时。
12. 向含有细胞的24孔板的每个孔中加入各种浓度的阿霉素或顺铂，并水平摇动24孔板以混合药物（不需要更换培养基）。
13. 将细胞再培养3天。
14. 弃去上清液，用1x PBS冲洗每个孔
15. 向每个孔中加入0.5ml胰蛋白酶-EDTA
16. 收集取消关联的单元格，并通过Coulter计数器计数单元格数量。
对于球体细胞
1. 96孔板的制备：
  1. 将琼脂糖粉末溶解在Milli Q水中
  2. 准备0.7％琼脂糖溶液，通过高压灭菌消毒使用。
  3. 将20μl的0.7％琼脂糖分配到96孔板的每个孔中。
  4. 在室温下放置96孔板20分钟。
  5. 96孔板可以在琼脂糖凝固后使用。
2. 在癌干细胞培养基中维持骨肉瘤球体细胞的储备培养物（图2）
  
  图2.骨肉瘤球。球状细胞悬浮在癌干细胞培养基中培养。
3. 当球体直径达到100μm时，将移液管球体装入50ml离心管中，并通过在500rpm离心3分钟收集细胞。
4. 弃去上清液;消化球与胰蛋白酶（0.05％），胶原酶I（0.1％）和胶原酶IV（0.1％）的混合物在37℃下2分钟。
5. 当球体消化为单细胞时，用0.05％胰蛋白酶抑制剂终止消化反应
6. 通过在800rpm离心5分钟收集细胞。通过没有抗生素的癌症干细胞培养基悬浮细胞沉淀。用于化学敏感性测定的癌干细胞培养基是不含抗生素的。
7. 通过Coulter计数器计数细胞。
8. 用癌干细胞培养基调节细胞密度为50,000个细胞/ml
9. 分配100微升细胞悬液（50,000细胞/毫升）到96孔板的每个琼脂糖涂覆的孔。
10. 孵育细胞在潮湿的孵化器（37°C，5％CO 2）24小时。
11. 向含有细胞的96孔板的每个孔中加入1μl不同浓度的阿霉素或顺铂，并水平摇动96孔板以混合药物（不需要更换培养基）。
12. 在潮湿的培养箱（37°C，5％CO 2）中孵育细胞72小时。
13. 解冻CellTiter 96 ^® AQueous One溶液试剂。
14. 吸取20μl的CellTiter 96 AQueous One溶液试剂到含有100μl培养基中的细胞的96孔板的每个孔中，并水平摇动96孔板以混合试剂（不需要更换介质）。
15. 在37℃在潮湿的培养箱（37℃，5％CO 2）中孵育平板2小时。
16. 使用Microplate Reader 680记录490nm处的吸光度
对于用TGF-β1信号传导抑制剂SB431542预处理的球状体细胞。
1. 96孔板的制备：
  1. 将琼脂糖粉末溶解在Milli Q水中
  2. 准备0.7％琼脂糖溶液，通过高压灭菌消毒使用。
  3. 将20μl的0.7％琼脂糖分配到96孔板的每个孔中。
  4. 在室温下放置96孔板20分钟。
  5. 96孔板可以在琼脂糖凝固后使用。
2. 保持肿瘤干细胞培养基中骨肉瘤球体细胞的储备培养。
3. 用癌症干细胞培养基中的376nM SB431542（溶解于0.01％DMSO中）预处理骨肉瘤球体细胞3天（或用0.01％DMSO预处理用于对照）。
4. 移液球到50ml离心管中，并通过在500rpm离心3分钟收集细胞
5. 弃去上清液;消化球与胰蛋白酶（0.05％），胶原酶I（0.1％）和胶原酶IV（0.1％）的混合物在37℃下2分钟。
6. 当球体消化为单细胞时，用0.05％胰蛋白酶抑制剂终止消化反应
7. 通过在800rpm离心5分钟收集细胞。通过没有抗生素的癌症干细胞培养基悬浮细胞沉淀。用于化学抗性测定的癌干细胞培养基是不含抗生素的。
8. 通过Coulter计数器确定细胞数量。
9. 用癌干细胞培养基调节细胞密度为50,000个细胞/ml
10. 分配100微升细胞悬液（5,000个细胞/孔）到96孔板的每个琼脂糖涂覆的孔。
11. 孵育细胞在潮湿的孵化器（37°C，5％CO 2）24小时。
12. 向含有细胞的96孔板的每个孔中加入1μl不同浓度的阿霉素或顺铂，并水平摇动96孔板以混合药物（不需要更换培养基）。
13. 在潮湿的培养箱（37°C，5％CO 2）中孵育细胞72小时。
14. 解冻CellTiter 96 ^® AQueous One溶液试剂。
15. 吸取20μlCellTiter 96 AQueous One溶液试剂到含有100μl培养基中的细胞的96孔板的每个孔中，并水平摇动96孔板以混合试剂（不需要更换介质）。
16. 在37℃在潮湿的培养箱（37℃，5％CO 2）中孵育平板2小时。
17. 使用Microplate Reader 680记录490nm处的吸光度
  食谱
  1. PBS，不含Ca ²⁺和Mg ^{2 +}
    8g/L NaCl
    0.2 g/L KCl
    1.42g/L Na 2 HPO 4
    0.27g/L KH 2 PO 4 sub/
  2. 无血清培养基
    2.5 mg/L胰岛素 5mg/L载脂蛋白转运蛋白
    1mM 2-巯基乙醇 1mM乙醇胺 1μM亚硒酸钠
  3. 癌干细胞培养基
    胰岛素（10mg/L）
    载脂转铁蛋白（5mg/L） 2-巯基乙醇（1mM）乙醇胺（1mM）
    亚硒酸钠（2μM）
    BSA（9.4mg/L）
    油酸（1.88mg/L）
    肝素（150μg/L）
    L-抗坏血酸2-磷酸三钠盐（10mg/L）
  致谢
  
  本研究部分得到了国家高新技术开发项目（No. 2008AA092604），国家基础研究计划（No. 2009CB945400）和广东科技规划项目（No. 2009B030803037）资助。
  
  参考文献
  1. Adhikari，A.S.，Agarwal，N.，Wood，B.M.，Porretta，C.，Ruiz，B.，Pochampally，R.R。和Iwakuma，T。（2010）。 CD117和Stro-1可识别与转移和耐药性相关的骨肉瘤肿瘤起始细胞。 Cancer Res 70（11）：4602-4612。
  2. Ginestier，C.，Liu，S.，Diebel，ME，Korkaya，H.，Luo，M.，Brown，M.，Wicinski，J.，Cabaud，O.，Charafe-Jauffret，E.，Birnbaum，，Guan，JL，Dontu，G。和Wicha，MS（2010）。 CXCR1封锁可有选择性地靶向体外人类乳腺癌干细胞和异种移植物。 J Clin Invest 120（2）：485-497。
  3. Haraguchi，N.，Ishii，H.，Mimori，K.，Tanaka，F.，Ohkuma，M.，Kim，HM，Akita，H.，Takiuchi，D.，Hatano，H.，Nagano，，GF，Doki，Y。和Mori，M。（2010）。 CD13是人类肝癌干细胞的治疗靶点 J Clin Inves t 120（9）：3326-3339。
  4. Zhang，H.，Wu，H.，Zheng，J.，Yu，P.，Xu，L.，Jiang，P.，Gao，J.，Wang，H.and Zhang，转化生长因子β1信号对于癌细胞对骨肉瘤中癌干细胞的去分化至关重要。 a> Stem Cells 31（3）：433-446。