材料和试剂

细胞系：OECM-1（Huang等人，2004）和FaDu（ATCC HTB-43 ^TM）
0.1％胰蛋白酶-EDTA（Life Technologies，Gibco ，目录号：15400）
0.1mg/ml聚-L赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P9404-25MG）
PBS
FBS（Thermo Fisher Scientific，目录号：SH30071.03）
牛胶原溶液（Advance Biomatrix Inc.，目录号：5005-B）
1M NaOH溶液
5x RPMI培养基
3％多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：P6148-500G）
0.5％Triton X100（Bionovas，目录号：56-81-5）
Alexa Fluor 488鬼笔环肽（Life Technologies，目录号：A12379）
DAPI（Sigma-Aldrich，目录号：D8417）
1％BSA的PBS溶液中
1.8 mg/ml胶原I混合溶液（见配方）

设备

Lab-Tek 腔室＃1.0盖玻片系统（NUNC，目录号：155383）
具有60x油透镜（Olympus，型号：FV1000）的激光共聚焦显微镜
CO <2>孵化器

软件

Olympus FV10-ASW 1.7软件

程序

第1天

在37℃下用300μl的0.1mg/ml聚-L赖氨酸溶液处理Lab-Tek 腔室＃1.0盖玻片系统一小时。
吸出聚-L赖氨酸溶液，用PBS洗一次。
将在500μl培养基中的胰蛋白酶化细胞和2×10 5个细胞接种在盖玻片系统上用于附着。
在附着时间3至6小时后，在冰上准备适当体积的胶原I混合溶液（终浓度1.8毫克/毫升），然后小心地从盖玻片系统中除去培养基（避免再次洗涤细胞），并加入500微升胶原蛋白I 混合溶液到盖玻片系统
将细胞在37℃，5％CO 2下孵育2小时
用400μl含有15％FBS的培养基在胶原凝胶上覆盖
在37℃，5％CO 2下孵育24至48小时

第2或3天

小心地从孔中吸出培养基并冲洗孔，包括用PBS浸润的胶原蛋白凝胶一次
小心地倒入400微升3％多聚甲醛的PBS溶液中40分钟，以固定细胞
用400μlPBS小心冲洗两次。
在400μl0.5％Triton X-100的PBS中在室温下透化40分钟
用400μlPBS小心冲洗两次。
用400μl1％BSA的PBS溶液在室温下孵育细胞40分钟
用500μl在PBS中稀释至1单位/ml的Alexa Fluor？488鬼笔环素在室温下染色细胞90分钟。
用PBS小心冲洗两次。
用500μl2μg/ml DAPI在PBS中染色细胞30分钟
用400μlPBS洗涤三次，并吸出所有PBS
样品可以在4℃下储存2周或者准备通过激光共聚焦显微镜成像。成像和定量。
使用Olympus FV1000激光共聚焦显微镜与60x油镜头捕获图像。观察的体积为xyz = 210×210×50μm³
共聚焦Z切片被收集每个井从井底部50μm，z间隔设置为1微米
获得顺序Z切片的图像，并通过Olympus FV10-ASW 1.7软件重建。

图1.24小时后侵入胶原蛋白的FaDu过表达Twist1细胞的代表性图像（详情请参阅参考文献1）
入侵指数被定量为在30至50μm之间的从载玻片的底部的距离处除以总细胞数所存在的细胞数。
注意：部分落入30-50微米范围内的细胞也可以计数。
数据表示为对照样品和代表性垂直切片的侵入指数的百分比。

食谱

1.8mg/ml胶原I混合溶液
1.7ml PureCor 牛胶原溶液（3mg/ml） 0.6ml 5x RPMI
18μl1M NaOH
将dH sub 2 O加到3ml
中所有缓冲液必须在冰上，然后在组织培养箱中聚合。此混合溶液必须新鲜配制使用。

致谢

该协议如Sanz-Moreno等人（2008）中所述进行，进行了微小的修改。该方案的建立由国家健康研究所（NHRI-EX100-10037BI至M-H.Y .; NHRI-EX100-9931BI至K-J.W。）资助;国家科学委员会（NSC 99-2314-B-010-007-MY3和100-2321-B-010-015至M-H.Y .; NSC 100-2321-B-039-002至M-C.H。台北退伍军人综合医院（VGH 100-C-088，101-C-005至M-H.Y。）;退伍军人综合医院大学台湾系统联合研究计划（VGHUST101-G7-4-1至M-H.Y。）;教育部赠款，顶尖大学计划（至M-H.Y。）;卫生部，癌症研究卓越中心（DOH100-TD-C-111-007至M-H.Y; DOH101-TD-C-111-005至M-C.H。）的赠款;中国医科大学和医院的姐妹机构基金和MD安德森癌症中心。

参考文献

Huang，G.C.，Liu，S.Y.，Lin，M.H.，Kuo，Y.Y.and Liu，Y.C。（2004）。顺铂和紫杉醇在杀死口腔鳞状细胞癌中的协同细胞毒性 Jpn J Clin Oncol 34（9）：499-504。
Yang，W. H.，Lan，H. Y.，Huang，C. H.，Tai，S. K.，Tzeng，C. H.，Kao，S. Y.，Wu，K. J.，Hung，M. C. and Yang，M. H.（2012）。 RAC1激活介导Twist1诱导的癌细胞迁移 Nat Cell Biol 14（4）：366-374。