图1.使用丙酮酸，辅酶A和甲基紫精（Ctrl +）的活性测定。在没有丙酮酸盐的情况下，不发生甲基紫精减少（Ctr-）。

材料和试剂

注意：所有试剂都是新鲜溶解在厌氧帐篷中

设备

程序

使用NanoDrop在A 280nm处测量来自2L细胞培养物的异源表达和纯化的PFR1的蛋白浓度。（ref bio-protocol： Hisologous Production and Anaerobic Purification of His-和StrepII-tagged重组蛋白）。
所有还原测定在室温下在厌氧气氛（1％H 2 O，99％N 2）下进行。
反应混合物含有在0.1mM Tris-HCl（pH8）中的10mM丙酮酸钠，2mM钠辅酶A，5mM焦磷酸硫胺素，10mM甲基紫精和16mM二硫赤藓糖醇。
为了开始催化，将最终浓度为1.4μM的PFR1加入到反应混合物中，并且可以每30秒监测时间分辨的吸光度（A 604，96孔板读数器），直到达到饱和。 >
为了测定酶活性，可以使用摩尔消光系数ε<0.04> = 13.6mM cm -1 ^{-1（Mayhew，1978） Law（Eq.1）。一个单位定义为每分钟分别转化1摩尔丙酮酸或CoA和还原2摩尔甲基紫精。

E _λ =ε _{λ ^{。 c ^{。 d （Eq.1）
E _λ：消光
ε<λ>：消光系数
c：浓度
d：层厚度}}}}

食谱

0.1M Tris-HCl缓冲液（pH8.0）（1000ml）将12.114g Tris碱与800ml dH 2 O混合用HCl
调节pH至8 将ddH <2> O添加到1,000 ml
在121°C高压灭菌20分钟
存储在4°C

致谢

酶依赖性甲基紫精还原的动力学改编自Zeikus等人（1977）。丙酮酸：来自C的铁氧还蛋白氧化还原酶的研究。 reinhardtii 得到Anja Hemschemeier和Thomas Happe的科学支持。

参考文献

Mayhew，S.G。（1978）。连二亚硫酸盐和SO-2从与黄素氧还蛋白，甲基紫精和氢加氢酶的平衡反应的氧化还原电位。 Eur J Biochem 85（2）：535-547。
Noth，J.，Krawietz，D.，Hemschemeier，A.and Happe，T。（2013）。丙酮酸：铁氧还蛋白氧化还原酶偶联于莱茵衣藻中与光无关的氢产生

J Biol Chem 288（6）：4368-4377。
Noth，J。（2013）。 His和StrepII标记的重组蛋白的异源生产和厌氧纯化生物方案 3（17）：e881。