图1。 3 dpi 拟南芥 javanica 。蓝线表示收集的材料，加上一小部分根（容易处理），冷冻并加工以进行RNA提取。

材料和试剂

M所感染的拟南芥。 javanica （3 dpi或7 dpi）
TRI试剂（分子研究中心，MRC，目录号：TR-118）
氯仿（Scharlau，目录号：CL02031000）
异丙醇（Merck KGaA，目录号：09634）
柠檬酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：s4641）
氯化钠（Duchefa，目录号：S0520）
NaOH（Duchefa，目录号：s0523）
乙醇（Merck KGaA，目录号：100986）
焦碳酸二乙酯（DEPC）（Sigma-Aldrich，目录号：D5758）
无RNase水
丙酮（Thermo Fisher Scientific，目录号：A/0600/17）
液氮
RNeasy迷你包（QIAGEN，目录号：74104））
RNase-Free DNase Set（QIAGEN，目录号：79254）
高盐沉淀溶液（见配方）

设备

离心机
Microfuge
1.5 ml Eppendorf ^®管
瓷砂浆和杵，纹理表面在碗内部，直径60毫米
通风橱

程序

注意：对于所有程序，请使用手套和护目镜。

胆汁收集：为了以良好的效率进行从疱疹的RNA分离，应当收集在感染后3天（3dpi）或者在7dpi下100-150μg的250-300个手部切开的疱疹。收集gall子，并在液氮中快速冷冻至1.5ml Eppendorf 管。
注意：如果按比例缩小，RNA产量不与组织量成比例。您可以在同一个Eppendorf ^®中累积来自独立收集事件的。。
储存于-80℃直至进一步处理（步骤C）。
均质化：
1. 用丙酮清洁砂浆和杵，让它们在工作台上干燥并高压灭菌以避免RNA酶活性。注意：检查提取过程中使用的砂浆，杵和移液管没有与RNases接触。有时，优选保持材料专用于RNA提取。
2. 用杵将液氮加入研钵中冷却。
3. 将galls加入砂浆，进入通风橱。
4. 当液氮几乎蒸发时，加入TRI试剂（500-750μl/200-300加仑，3dpi）;总体积不应超过用于均质化的TRI试剂的体积的10％，如TRI试剂方案所示。
5. 用研钵和杵研磨gall。 TRI试剂溶液最初变得冻结，但由于均质化它将逐渐融化。进行直到观察到液体外观，并且在试剂溶液内没有发现可见的组织碎片。
  注意：不要在没有均匀化的情况下留下痕迹，因为这一步可能会限制效率。
6. 用移液管将胆汁匀浆转移到1.5ml Eppendorf管中，并将其置于冰上，同时使其余样品均匀。
相分离
1. 在4℃下以12,000×g离心10分钟，并将含有RNA的上清液转移到新的1.5ml Eppendorf管中。
  注意：所得沉淀含有膜，多糖和高分子量DNA，而上清液含有RNA。所有不溶物应从匀浆中除去。
2. 在通风橱中每500μlTRl Reagent ^{®加入100μl氯仿。牢固盖住样品管。}
3. 用手剧烈摇动管15秒，并在室温（RT）下孵育5至10分钟。
  注意：不要使用涡流。
4. 在4℃下以12,000xg离心样品15分钟。
5. 将上层水相转移到新管中
RNA沉淀
1. 每500μlTRl Reagent 加入125μl异丙醇和125μl高盐缓冲液。混合溶液，在室温下保存5-10分钟。
  注意：高盐沉淀溶液可从分离的RNA中除去作为蛋白多糖和多糖的污染化合物。
2. 在4℃下以12,000xg离心8分钟。
3. 弃去上清液。
RNA洗涤
1. 用1ml 75％乙醇洗涤RNA沉淀，并颠倒混合数次
2. 在4℃下以7,500×g离心5分钟，弃去上清液。
3. 重复步骤E-1和2.
4. 旋转10秒在微量离心机，仔细丢弃剩余的液体。
5. 空气干燥颗粒3-5分钟。不要让RNA过干，因为这会使其难以溶解。白色RNA沉淀物在干燥时会变澄清。
6. 在沉淀物清除后立即加入100μlDEPC-水或无RNase的水
7. 通过在37℃下孵育10分钟，然后在60℃下5分钟溶解RNA
8. 将RNA溶液储存在-80°C或继续进行RNA清洗通过DNase消化
在DNase I消化和RNA净化中合并。该程序基于两种不同的商业试剂盒（RNase-Free DNase Set和RNeasy Mini Kit）的组合使用。请按照其建议使用所有缓冲液和试剂的处理说明注意：缓冲区作为RPE，RTL，RW1，RDD由套件中的公司提供。开始RNA清除之前，请确保DNA酶I和缓冲液RPE可以使用。
1. DNase I储备溶液的制备：使用无RNase的针和注射器将550μl无RNA酶的水注入冻干的DNase I小瓶中。通过颠倒小瓶轻轻混合，并将其分成10μl一次性使用的等分试样。 -20℃保存9个月。
2. 缓冲液RPE的制备：如瓶中所示加入4体积的96-100％乙醇（44ml）
3. 用无RNase的水将RNA样品体积调节至100μl。
4. 加入350μl缓冲液RLT，并通过吸移混匀
5. 加入250μlEtOH，通过吸移混匀
6. 将样品转移到置于2ml收集管中的RNeasy Mini离心柱。轻轻关闭盖子，以8,000×g离心15秒。丢弃流出物。
7. 向RNeasy离心柱中加入350μl缓冲液RW1。轻轻关闭盖子，以8,000×g离心15秒。丢弃流出物。
8. 加入70μl缓冲液RDD（随RNase-Free DNase Set提供）至10μlDNA酶I储备液。通过倒置管子轻轻混合。
  注意：不要涡旋。
9. 将80μlDNase I孵育混合物加入RNeasy离心柱中，在室温下置于台上15分钟。
  注意：将混合物直接添加到RNeasy旋转柱膜的中心。
10. 向RNeasy离心柱中加入350μl缓冲液RW1。轻轻关闭盖子，以8,000×g离心15秒。丢弃流出物。
11. 向RNeasy离心柱中加入500μl缓冲液RPE。轻轻关闭盖子，以8,000×g离心15秒。丢弃流出物。
12. 向RNeasy离心柱中加入500μl缓冲液RPE。轻轻关闭盖子并以8,000×g离心2分钟。
  注意：长离心干燥旋转柱膜，消除乙醇污染。
13. 从收集管中快速取出RNeasy离心柱，以使色谱柱不接触流出物
14. 将RNeasy离心柱置于新的2ml收集管中。轻轻关闭盖子，全速离心1分钟。
  注意：重要的是消除任何可能的缓冲区RPE残留。
15. 将RNeasy离心柱置于新的1.5 ml收集管中。加入30μl无RNase水或DEPC水到离心柱膜的中心。在室温孵育1分钟。轻轻关闭盖子并以8,000×g离心1分钟以洗脱RNA。
16. 添加20微升无RNA酶水或DEPC水到离心柱膜的中心，以洗脱最大RNA。在室温孵育1分钟。轻轻关闭盖子，以8000xg离心1分钟。
17. 使用Nanodrop和/或生物分析仪测试RNA的数量和质量。你应该得到5-10微克的总RNA，从250-300收集的gall，在3 dpi的高质量
18. 将RNA样品储存在-80℃以备将来使用

食谱

高盐沉淀溶液
0.8 M柠檬酸钠 1.2 M NaCl

致谢

该协议改编自Barcala等人（2010）和Portillo等人（2013）。

参考文献

Barcala，M.，Garcia，A.，Cabrera，J.，Casson，S.，Lindsey，K.，Favery，B.，Garcia-Casado，G.，Solano，R.，Fenoll，C.and Escobar，C 。（2010）。显微解剖的拟南芥线虫诱导的巨细胞中的早期转录组事件。 a> Plant J 61（4）：698-712。
Portillo，M.，Cabrera，J.，Lindsey，K.，Topping，J.，Andres，MF，Emiliozzi，M.，Oliveros，JC，Garcia-Casado，G.，Solano，R.，Koltai， Resnick，N.，Fenoll，C。和Escobar，C。（2013）。番茄相比拟南芥中的线虫诱导的巨细胞发育过程中的不同和保守的转录组变化：功能角色用于基因抑制。新植物 197（4）：1276-1290。

Portillo，M.，Fenoll。 C.和Escobar C.（2006）。评估少量植物组织的不同RNA提取方法：试剂类型和均质化程序对RNA质量完整性和产量的组合效应。生理药理学 128（1）：1-7。